研究背景及研究目的:脊椎动物心脏是在胚胎发育过程中最早形成并发挥功能的器官。心脏发育是一个极其精准而复杂并且时空相关的过程,其间涉及一系列关键事件的发生,这些关键事件受多条信号通路在时间和空间上的精准调控,任何环节调控失衡都将会影响心脏功能的正常发挥并诱发先天性心脏病。Numb家族蛋白(NFPs)是一个细胞命运决定子,其家族包括Numb和Numblike(Numb1)。最新研究表明NFPs缺失导致小鼠胚胎流出道形成缺陷,暗示NFPs在流出道发育过程中的重要作用,但其机制尚不明确。同时,我们还发现在Numb和Numbl双基因敲除的胚胎心脏中,Notch1信号通路被异位激活,暗示NFPs在心脏发育过程中的功能可能依赖Notch1信号通路。我们通过应用Cre-loxp系统在心肌祖细胞中特异性敲除Numb、Numbl和Notchl得到Numb、Numbl双重基因敲除胚胎和Numb、Numbl、Notch1的三重基因敲除胚胎,探讨Notch1信号通路与NFPs在心脏发育过程中的关系。在研究过程中,我们还发现,在Numb、Numbl双重基因敲除胚胎的心脏中,Hey2的表达发生改变,因此我们对影响Hey2在心脏中的表达水平和表达模式的信号通路进行了深入的研究和探索1。本研究将在一定程度上阐明NFPs在心脏流出道形成过程中的功能及其调控机制并确定NPFs在心脏小梁的形成过程中如何依赖Notch1信号通路发挥作用,同时阐明Hey2在心脏发育过程中的时空表达方式,将有助于人们进一步认识了解先天性心脏病,为其治疗和干预提供研究基础。实验方法:1.特异性基因敲除小鼠的建立:我们通过Cre-loxp系统建立所需要的特异性基因敲除胚胎。我们通过心脏特异性表达的Nkx2.5cre/+、心内膜特异性表达的Nfatc1cre/+和内皮细胞特异性表达Tie2-cre分别对心肌细胞、心内膜细胞和内皮细胞中的靶基因进行特异性敲除2。2.mRNA deep sequencing和Protein array分析:通过收集对照组和突变组胚胎心脏样品进行mRNA deep sequencing和Protein array分析,对结果进行分析筛选并结合文献报道,确定有表达差异的基因及对应的信号通路。3.机制分析:(1)利用免疫荧光染色及RNA原位杂交技术验证相关基因蛋白和mRNA表达水平及表达方式。(2)通过Western Blot和Q-PCR进一步验证相关基因的蛋白和mRNA表达水平。(3)通过小鼠胚胎体内给予FGF2刺激和胚胎体外培养并进行FGF2刺激以验证相关信号通路对Hey2表达水平和表达模式的影响。实验结果:1.通过EdU标记检测流出道心肌细胞的增殖,发现流出道心肌细胞的增殖具有空间差异性,表现为左右两侧的心肌细胞不均等增殖,在NFPs缺失的情况下,这种表型被打破。2.NFPs缺失的情况下导致Pitx2表达降低,并且在流出道的表达模式发生变化。3.NFPs缺失导致心脏神经嵴细胞数量减少,其原因和MDKO中心脏神经嵴细胞的增殖降低有关。4.NFPs缺失导致第二生心区祖细胞增多,且排列紊乱。5.心肌细胞Notch1敲除能够部分挽救Numb、Numbl双基因敲除所导致的小梁形成缺陷。6.心肌细胞Notch1敲除能够部分降低Numb、Numbl双基因敲除所导致的小梁区心肌细胞过度增殖。7.Notch1/β-catenin/Isl1 信号通路在 NFPs 缺失情况下上调,在 Numb、Numbl、Notch1三重基因敲除的心脏中下调。8.Hey 在心脏发育中的表达具有时间和空间特异性。9.Notch、Nrg/ErbB2,4和YAP信号通路在心脏发育过程中能够调控Hey2表达水平,但不调控其表达模式。10.FGF信号通路在心脏发育过程中调控Hey2的表达水平和表达模式。结论:1.NFPs通过影响Nodal-Pitx2信号通路调控流出道心肌细胞的增殖,通过调控心脏神经嵴细胞的增殖及第二生心区祖细胞的活动影响流出道的形态发生。2.NFPs通过Notch1信号通路影响心脏小梁的形成。3.Hey2在心脏发育过程中的表达具有时空依赖性,FGF信号通路能够调控Hey2的表达水平和表达模式。