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第一部分(一)研究背景细胞凋亡是一种主动、有序、多基因调控的细胞逐渐死亡过程,是生命的基本现象之一。细胞凋亡大致可分为caspase依赖的和caspase非依赖的细胞凋亡两大类。目前,研究认为凋亡诱导因子AIF在caspase非依赖的细胞凋亡途径中起着关键作用。1.AIF是定位于线粒体膜间隙的黄素结合蛋白,其在特定的凋亡诱导信号刺激下,会从线粒体转移到核内从而引起染色质凝缩和DNA片段化。2.研究也发现与AIF同源的AIFM2(又名AMID)同样可以引起caspase非依赖的细胞凋亡。(1)AIFM2在结构上虽然与AIF相比缺失了线粒体定位序列片段,但是均具有与细菌氧化还原酶高度同源的NADH氧化还原酶区,可以结合一个FAD和一个NADH。(2)AIFM2大部分位于线粒体外膜,少数位于胞浆。虽然详细的机制还没有被研究清楚,已有的报道表明AIFM2对细胞核以及染色质的作用与AIF相似。另外bcl-2不能抑制AIFM2诱导的凋亡。为了探究AIFM2发挥生物学功能的结构基础和分子机制,我们对AIFM2进行了结构与功能的初步研究。(二)研究结果1.我们建立了AIFM2全长重组蛋白及突变体(含截短体)在原核中大量表达与纯化的方法,得到了纯度高且稳定的目的蛋白。2.为了蛋白晶体的顺利获得,我们选取、并用同样的方法表达并纯化了AIFM2同源蛋白,然后通过晶体生长和优化,获得了同源蛋白的较好单晶。第二部分(一)研究背景环二腺苷酸cyclic di-AMP是存在于细菌中的第二信使核苷酸。1.近年来,很多研究结果已经证实c-di-AMP能够参与调节多种生命活动,其中包括K+稳态调节、DNA修复、生物膜形成、中枢代谢、毒力调节及基因表达调控等。2.并且c-di-AMP还被认为是一种潜在的疫苗佐剂。因此,建立一种更简单、更经济的方法来大量制备c-di-AMP具有很好地应用前景。(二)研究结果1.在本论文中,我们利用霍乱弧菌中的二核苷酸环化酶DncV建立了一种实用的c-di-AMP的大量制备酶学方法。我们在体外证实DncV可高效催化合成c-di-AMP,且无明显的产物抑制现象。我们制备c-di-AMP的方法包括四个步骤:(1)将带His标签的DncV重组蛋白特异地结合在Ni-NTA基质上;(2)利用固化在基质上的DncV蛋白高效催化合成c-di-AMP;(3)再使用大孔树脂SP207进行一步纯化;(4)最后将收集液氨化中和和旋蒸干燥。2.通过该方法,在最佳反应条件(300 mM NH4Ac/NH3 pH 9.5,20 mM MnCl2,12.5 mL Ni-NTA基质固化约19 mg DncV,10 mM ATP,30℃,反应体积300 mL)下,以及使用400 g大孔树脂SP207进行纯化,我们获得了接近1g的c-di-AMP二铵盐白色粉末,纯度>98%,并且根据加入的ATP的量计算,所得总产率为82%。我们的实验结果表明该方法明显优于所有已报道的方法,可以应用于工业上大量制备c-di-AMP。