扩展蛋白( Expansin )能够通过调节细胞壁的膨胀来控制植物细胞的生长进而可以调节根系的生长,平邑甜茶( Malus hupehensis ( Pamp ) Rehd. var pinyiensis Jiang )是苹果和观赏海棠的优良砧木之一,而根系是农业生产措施的主要作用中心。为从分子水平揭示根系生长发育的机理,并为运用生物技术调控根系生长提供理论依据,本试验以平邑甜茶为试材,从其白色新根中分离到两个扩展蛋白同源基因,对它们进行了生物信息学分析,并研究了这两个基因的时空表达及其与内源激素和ATPase的关系,还构建了pBI121-MhEXP2载体,获得了MhEXP2原核表达蛋白。主要结果如下:1.根据已知扩展蛋白基因序列设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术获得了两个扩展蛋白基因,分别命名为MhEXP1和MhEXP2。GenBank注册号分别为DQ538346和DQ993160。2.序列分析表明,MhEXP1 cDNA全长1111bp,含有771 bp的完整开放阅读框,编码257个氨基酸,预测分子量和等电点分别为27.8kD和8.9。MhEXP2 cDNA全长1320bp,含有762bp的完整开放阅读框,编码254个氨基酸,预测分子量和等电点分别为26.8kD和9.4。MhEXP1和MhEXP2具有扩展蛋白的典型结构,即氨基酸序列N端有8个半胱氨酸残基,1个组氨酸( His-Phe-Asp,HFD )域,C末端存在4个保守的色氨酸残基。同源分析发现,二者氨基酸水平上的同源性为56.98%。聚类分析发现,MhEXP1蛋白与α-EXP的第V亚家族亲缘关系最近;MhEXP2蛋白与α-EXP的第I亚家族亲缘关系最近。结果表明,我们已经分离到平邑甜茶根系扩展蛋白基因。通过PlantCARE分析发现,MhEXP1和MhEXP2都具有生长素顺式作用原件,MhEXP2还有茉莉酸诱导( TGACG-motif )、低温诱导( LTR )、热胁迫诱导( HSE )等顺式作用原件。因此,我们推测MhEXP2基因除了参入了植物的生长发育,还可能与植物与逆境的适应有关。3. Northern杂交分析平邑甜茶扩展蛋白的表达发现,MhEXP1基因在平邑甜茶根系中特异表达,且其表达受IBA的调控。MhEXP2基因在平邑甜茶根和叶中都表达,它的表达也受IBA的调控。4.通过对Ca2+-ATPase活性和H+-ATPase活性测定发现,Ca2+-ATPase活性早于H+-ATPase活性先达到高峰,因此推测作为第二信使的Ca2+可能激活了H+-ATPase活性。而H+-ATPase活性在扩展蛋白前达到高峰,为扩展蛋白提供了一个适宜酸性的环境,这有利于扩展蛋白的功能的发挥。5.通过对平邑甜茶根系内源激素的测定,发现促进扩展蛋白的表达不仅仅受生长素的绝对含量所调控,而是受IAA/ABA的相对含量所调控。6.构建了pBI121-MhEXP2正义表达载体,并对烟草进行了农杆菌侵染。将MhEXP2编码区正向克隆到原核表达载体pET30a-c(+),并通过原核表达获得了MhEXP2蛋白,为进一步研究扩展蛋白的功能提供了条件。