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淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）1628是一株丰加霉素（Toyocamycin,TM）产生菌,丰加霉素在植物病害防治领域具有良好的应用前景。为考察淀粉酶产色链霉菌1628中丰加霉素合成的分子调节机制,本文克隆了1628菌株生物合成丰加霉素基因簇并验证其功能;研究了基因簇中途径特异性调节基因toyA,初步揭示了其参与丰加霉素合成的正向调控;最后以β-葡萄糖苷酶编码基因gusA和基因簇中的toyF基因作为报告基因,比较了多个不同启动子在菌株1628的转录活性强弱并测试其适用性。主要研究内容如下:首先,以S.diastatochromogenes 1628 DNA为模板,设计特异性引物,利用PCR,Gibsen Assembly的方法克隆了大小为10.4 kb的丰加霉素基因簇toy cluster（GenBank:KY022432.1）。其与龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）和不吸水链霉菌（Streptomyces ahygroscopicus）中丰加霉素基因簇的核苷酸序列的相似度分别为75%,99%。通过接合转移法,将toy cluster在模式菌株S.albus J1074中异源表达,获得重组菌J1074-CLU,经发酵和HPLC检测,J1074-CLU的发酵液中含有丰加霉素。构建载体pSET152-cluster,将toy cluster在S.diastatochromogenes 1628中过量表达,获得重组菌株1628-CLU。重组菌的丰加霉素产量相对于原始菌株提高了105.7%。其次,经生物信息学分析,基因簇内的toyA基因编码的TOYA蛋白属于LAL家族,该家族是链霉菌内的一类途径特异性调节因子。以S.diastatochrom-ogenes 1628 DNA为模板,设计特异性引物,克隆toy A基因（GenBank:KT291433.1）,大小为2877 bp。将其构建到穿梭质粒pIB139上,获得重组质粒p IB139-toyA,再利用接合转移的方式转入菌株1628获得重组菌株1628-TOYA。发酵后其丰加霉素的产量相对于原始菌株提高了80.6%;经荧光定量PCR检测,重组菌中toyB,toyM,toyG及toyF基因的转录水平均显著高于原始菌株。构建重组质粒pET28a-adpAsd,将1628菌株中的多效性调节基因adpAsd在原核宿主大肠杆菌E.coli Rosseta中表达,获得可溶性的ADPAsd蛋白。经过EMSA分析,ADPAsd能够直接结合toyA基因的启动子序列。最后,为比较4个启动子permE*,kasOp*,SPL-21和SPL-57在1628菌株中的转录活性,以gusA为报告基因,构建了重组质粒pGUS-ermE,pDR4-GUS,pGUS-SPL-21,pGUS-SPL-57,分别利用接合转移法转入菌株1628,获得重组菌株1628-ES,1628-RS,1628-21S和1628-57S。经表型和GUS酶活分析,启动子SPL-21表现出较强的转录活性,是传统启动子permE*的5.2倍。为验证基因簇内编码腺苷琥珀酸裂解酶的toyF基因与丰加霉素合成的相关性,构建了敲除质粒pKC1132-toyF’,经接合转移法获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果显示,与原始菌株相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低了66.7%、87.5%。构建质粒p IB139-H-toyF,将toyF基因在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达,获得重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7倍和8.3倍。以上结果证实toyF基因参与菌株1628丰加霉素的合成。为进一步检测上述启动子在菌株1628中的适用性,将toyF基因置于不同的启动子下,在菌株1628中过量表达,获得重组菌1628-EF,1628-RF,1628-21F和1628-57F。与gusA作为报告基因的实验结果相一致,重组菌1628-21F显示出了最高的toyF基因转录水平,TOYF酶活和丰加霉素产量。5-L发酵罐实验结果表明1628-21F的丰加霉素产量比原始1628菌株提高了108.05%。