宫颈癌是女性生殖系统最高发的恶性肿瘤之一,全世界每年有将近30万的患者死于宫颈癌,我国宫颈癌的发病率位居世界第二。目前,宫颈癌的治疗方法主要有手术、放疗和化疗三种。放射治疗因其广泛的适应症而成为宫颈癌治疗的重要方法。除患者存在严重的肝肾功能损伤以及造血功能障碍外,各期宫颈癌患者均可接受放射治疗,对于中晚期、复发或者无法手术的患者,放射治疗则为首选。然而,由于患者个体体质的差异以及肿瘤的异质性,不同患者对放射治疗的反应不同,存在放疗敏感性和放疗耐受性差异,导致放疗的效果不同。据统计,有大约30~50%的宫颈癌患者在最初治疗结束后3年至5年内会面临复发和转移。有研究表明,放疗耐受是宫颈癌治疗失败并出现复发转移的重要原因。然而,到目前为止,产生放疗抗拒的机制尚不明确。如果能够阐明宫颈癌放疗耐受性的机制不仅可为宫颈癌个体化治疗的设计提供理论依据,也可为开发逆转宫颈癌放疗耐受的治疗手段提供新的思路,因此具有重要的理论意义和实际应用价值。目前认为肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC)是肿瘤组织中数量极少的一部分细胞,具备自我更新和多向分化潜能,以及表达干细胞表面标志物等特性。研究表明,在多种实体瘤包括宫颈癌中已经发现有肿瘤干细胞存在。但是何为宫颈癌干细胞的表面标志物尚未明确,因此,有关明确宫颈癌干细胞的表面标志物及如何分离和鉴定宫颈癌干细胞方面的研究一直备受关注。上皮间质转化(Epithelial–mesenchymal transition,EMT)是指上皮表型与细胞粘附分子表达的缺失,同时获得间质分子、成纤维细胞或间充质细胞表型及迁移能力。肿瘤细胞可以通过EMT的形式向间质细胞转化,侵入淋巴管和血管,从而发生转移。在种植部位,癌细胞还可通过间质细胞向上皮细胞转化(mesenchymal–epithelial transition,MET)重建细胞骨架及细胞间的粘附复合体,形成转移灶。与EMT相关的信号转导通路可以增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力和抗凋亡能力。越来越多的研究表明在肿瘤细胞放疗抵抗和获得emt分子表型间存在关联,而肿瘤干细胞的特点之一就是可以分化为具备emt表型的肿瘤细胞,因此与emt相关的肿瘤放疗抵抗可能与肿瘤干细胞密切相关。宫颈癌患者出现治疗后局部的复发和远处的转移,其原因主要是由于放疗抵抗。我们实验发现放疗抵抗的宫颈癌细胞中富集cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞,因此推测cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞具备抗拒放疗及部分干细胞的特性,并经历emt过程。基于上述分析以及预实验的结果,本论文拟对cd44+/cd24+表达阳性的细胞的放疗抵抗性、是否具备肿瘤干细胞特性以及其与宫颈癌复发转移的关系进行深入研究,旨在阐明宫颈癌放疗抵抗的机制,为临床上宫颈癌的个体化治疗提供理论基础。主要研究内容如下:第一部分cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌干细胞样特性的研究目的:探讨放疗抵抗的宫颈癌细胞的特性,揭示宫颈癌复发和转移的原因。方法:用多次分割照射获得耐放疗的宫颈鳞状细胞癌siha细胞,利用流式细胞仪从宫颈鳞癌的亲代细胞中分选获得cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞;将耐放疗的宫颈鳞癌细胞和cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞设为实验组,亲代宫颈鳞癌细胞设为对照组,分别进行克隆形成试验和肿瘤移植瘤试验,评估试验组细胞是否具备肿瘤干细胞特性;通过transwell侵袭试验研究实验组及对照组细胞侵袭和转移能力的差异;利用rt-pcr和western试验检测实验组及对照组细胞oct-4、survivin、abcg2和bcl-2mrna的表达,以及与肿瘤转移相关的e-cadherin和vimentin蛋白表达;应用spss11.5软件包进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示,计量资料进行t检验,以α=0.05为水准,p<0.05为差异有统计学意义。结果:放疗抵抗的宫颈鳞癌细胞和cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞高表达抗凋亡蛋白bcl-2和凋亡阻抑蛋白survivin,并表达肿瘤干细胞相关标志物oct4和abcg2。两实验组细胞均具有较强的致瘤能力以及侵袭和转移能力,且表现出e-cadherin下调和vimentin蛋白上调的emt相关的分子表型变化。统计学结果显示,实验组与对照组间比较差异显著(p<0.05)。结论:放疗抵抗的宫颈鳞癌细胞与cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞表现出相同的肿瘤干细胞特性,经历了emt过程,放疗可以富集宫颈癌干细胞。第二部分cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞放疗抵抗机制的研究目的:探讨cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞的放射敏感性及其抗拒放疗机制。方法:体外培养人宫颈鳞癌siha细胞,采用流式细胞分选仪分选出cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞,分别使用直线加速器给予实验组细胞和对照组细胞多次分割照射,选取累计剂量为8、16和30gy的多次分割照射后的宫颈癌细胞,用克隆形成实验拟合细胞存活曲线,根据do、dq、n及sf2值等放射生物学参数比较肿瘤细胞的放射敏感性;通过hochest33258荧光染色实验观察细胞凋亡的形态学变化;用透射电镜观察放疗前后宫颈癌细胞超微结构变化;用流式细胞术(fcm)分析各组细胞放疗后的细胞凋亡率;用dna片段凝胶电泳观察放疗后各组凋亡细胞的dna“梯状”条带;用rt-pcr法检测细胞凋亡相关基因mrna的表达情况。结果:宫颈癌siha细胞经放射线照射处理后,流式细胞检查显示:随着放疗剂量的增加,cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞比例增加;平板克隆形成实验显示cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞克隆形成率明显高于亲代细胞(p<0.05);hochest33258、dna片段凝胶电泳、透射电镜及流式细胞定量研究显示cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞未出现明显凋亡改变;rt-pcr显示cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞中bcl-2、survivin、oct4基因表达水平较对照组升高(p<0.01)。结论:cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞抗拒放疗诱导的细胞凋亡。第三部分干细胞相关标志物oct-4在宫颈癌组织中的表达及临床意义目的:探讨肿瘤干细胞相关标志物oct-4在宫颈鳞癌组织中的表达并分析oct-4基因和蛋白在宫颈癌发生、发展中的作用和意义。方法:选取自2009年5月至2010年4月河北医科大学第四医院妇瘤科收治的宫颈癌患者50例,其中高分化13例,中分化19例,低分化18例,临床分期为Ⅱb-Ⅲb期,年龄介于24~82岁,远处转移患者除外,治疗前均行全身CT或PET/CT检查。以20例正常宫颈鳞状上皮组织标本作为对照,分别利用免疫组化法和RT-PCR法在蛋白和核酸水平检测Oct-4基因和蛋白在正常宫颈组织及宫颈鳞癌组织中的表达。结果:RT-PCR检测显示Oct-4 mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织;免疫组化染色显示正常宫颈鳞状上皮组织不表达Oct-4蛋白,宫颈鳞癌组织中阳性表达率为56%,两者之间存在显著性差异(P<0.01)。Oct-4蛋白表达与患者年龄无关,而与宫颈鳞癌的组织学分化、治疗后复发转移密切相关(P<0.05),差异有统计学意义。结论:Oct-4基因在宫颈鳞癌组织中的表达比正常宫颈组织明显增加,在宫颈低分化鳞癌组织中的表达最高,随着宫颈癌分化程度的升高其表达率逐渐降低。Oct-4基因的表达可能在宫颈癌放疗抵抗中发挥重要作用。