多种或多个生物分子形成复合物来执行特定功能是细胞中非常常见的现象,如游离的核糖体和剪接体等,以及细胞膜上的离子通道和受体复合物等。了解这些复合物中各种或各个分子之间的相互位置关系和动态变化对于研究它们的结构和功能至关重要。然而,这些复合物通常为纳米级尺寸(通常小于100 nm)。目前虽有X晶体衍射、冰冻电镜和荧光能量共振转移等技术可以实现纳米尺度的检测,但都有各自的缺点。激光共聚焦显微镜目前已成为常规技术,却因分辨率不够(通常>250 nm)而无法实现这种检测。我们课题组的策略是,将不同长度的线性荧光探针特异性标记复合物中的不同分子,通过线性形貌来放大复合物中不同分子之间的位置关系,使得较低分辨率的荧光共聚焦显微镜也能用于探测复合物中不同分子间的位置关系。作为前期探索性研究,本课题的主要目是制备这种线性荧光探针,并做初步的应用测试。我们采用不同长度的双链DNA分子来作为线性荧光探针。其优点是,DNA分子易于大量合成;可精确控制其长度(可获得任意长度的DNA);双链DNA分子的直径只有2 nm;有多种成熟方法让双链DNA分子带上荧光;DNA分子还具有丰富的基团可与其他小分子物质通过共价结合的方式结合,从而实现对目标分子的特异性标记;等等。因此,DNA分子非常适合作为线性荧光探针的材料。本课题利用修饰了生物素基团的引物、使用PCR仪成功合成了足够量的三种长度(分别约为50 nm,500 nm和1200 nm)的线性探针,并且使用两种方法(核酸染料SYBR GREENⅠ和ROX)使得其成为线性荧光探针。通过凝胶电泳检测证明三种探针均成功合成;通过质谱检测,探针上游引物的5’末端确实成功连接上生物素基团,且凝胶电泳结果显示这些探针能与链霉亲和素分子特异结合;通过流式细胞仪检测,DNA荧光探针的荧光强度随着DNA链长的增加而增加,且荧光强度远超过常用染料FITC。随后,我们使用荧光共聚焦显微镜检测了DNA线性荧光探针在包被有链霉亲和素分子的磁珠表面(模拟细胞表面)的荧光效果。结果显示,特异性结合效果明显,且随DNA线性荧光探针链长的增长荧光强度也增加。进一步我们用荧光共聚焦显微镜检测了DNA线性荧光探针在无核细胞(红细胞)和有核细胞表面的荧光效果。结果也显示,线性荧光探针与如今使用广泛的强荧光试剂相比效果相类似或更强。本课题中我们利用DNA分子的特性设计了一种新型的线性荧光探针,旨在利用探针的不同长度来分辨复杂分子结构的不同组成部分,不仅仅是单纯的利用不同荧光来分辨,希望利用此技术突破现有荧光技术分辨率的局限性。本课题为前期探索性研究,成功合成这种线性荧光探针,并初步检测了其荧光效果。后续研究将选择合适的分子复合物模型,用这种线性荧光探针特异性标记该复合物上的两个或多个分子,用激光共聚焦显微镜等技术对这些不同长度线性荧光探针的线性进行直接成像验证。