论文部分内容阅读
先天性无阴道是由于胚胎发育时期双侧副中肾管发育不全所致的先天性畸形,治疗以手术为主,术式多达20余种,无论何种术式,都存在或多或少的缺陷,目前为止还没有一种最理想的治疗方式。如何创建一种副作用少、损伤小、更符合生理要求的新式治疗法凸显重要。随着细胞培养技术及生物工程技术的发展,从种子细胞来源和各种载体的选择,到体外构建及体内移植的成功,为实现这一目标提供了可能。
目的:
建立新的阴道粘膜上皮细胞分离方法,通过分选培养人阴道粘膜干细胞,以人脱细胞羊膜为载体,探讨气液界面培养法体外构建人阴道粘膜上皮的可能性。
一.中性蛋白酶和胰酶分离阴道粘膜上皮细胞的对比研究
方法:
1.取人阴道上皮随机分成两组,一组以中性蛋白酶(dispas)作消化液,另一组以胰酶作消化液,分离阴道粘膜上皮细胞进行体外培养。
2.两组得到的原代细胞分别进行细胞计数。
3.克隆形成率：原代细胞(P0)和第一代细胞(P1)分别以1000个细胞种植在六孔板中。15天后,丙酮固定,考马斯亮蓝染色,倒置显微镜下观察,以32个细胞或以上作为一个克隆计数。
4.dispase及胰酶处理后的组织块分别作冰冻切片,常规HE染色和角蛋白13(CK13)免疫组织化学染色,比较两种酶对组织的分离作用。
5.倒置显微镜下观察细胞,取第一代细胞爬片,鼠抗人广谱角蛋白(PAN)免疫细胞学染色。
结果:
Dispase和胰酶均能把上皮层与固有层分开,得到的细胞均呈PAN阳性染色,没有成纤维细胞污染。对于1cm2阴道上皮片,dispase组和胰酶组的原代细胞产量分别是9,898,800±983,310个细胞和3,428,800±328,430个细胞；阴道上皮细胞P0总的克隆形成率,dispase组比胰酶组要高,分别是2.13±0.17％,1.39±0.07％,有统计学差异；P1总的克隆形成率则相近,分别是1.44±0.10％,1.43±0.13％。形态学和CK13染色均可见胰酶的分离作用并不完整,细胞大部分仍附于固有层,而dispase组基底细胞则完整地分离开。
结论：
Dispase和胰酶消化法均能分离阴道粘膜上皮,而dispase的作用较胰酶更优越,能获得更多有活力的细胞。
二.利用阴道粘膜干细胞体外构建阴道粘膜上皮
方法：
1.取第2～3代在人阴道粘膜上皮细胞标记α6整合素和CD71行阴道粘膜干细胞流式分选。
2.进一步鉴定分选后的阴道粘膜干细胞,以表皮干细胞标记物p63、角蛋白19(CK19),终末细胞标记物CK13染色,并行蛋白质印迹分析(Western blot,WB)。
3.制备脱细胞羊膜：取择期剖宫产产妇的胎盘,无菌操作下钝性分离羊膜层。加入0.25％胰酶-EDTA 37℃温育30min,细胞刮刀轻刮羊膜表面,倒置显微镜下观察。
4.滋养层细胞的制备：胰酶消化鼠的胚胎获得鼠成纤维细胞,取第三代成纤维细胞用丝裂霉素C处理,作滋养细胞用。
5.以羊膜为载体,接种人阴道粘膜上皮干细胞,并按照3步培养法培养：低钙培养液培养7天-高钙培养液培养6天-气液培养7天。
6.阴道粘膜细胞羊膜片组织学检查：冰冻切片,常规HE染色,人广谱角蛋白(PAN)免疫组织学染色。制作透射电镜标本,透射电镜观察细胞超微结构。
结果:
流式细胞分选出的α6briCD71dim细胞为阴道粘膜干细胞,表皮干细胞标记物p63和CK19染色,呈阳性,终末分化细胞标记物CK13染色阴性；免疫印迹分析得到同样的结果,p63和CK19蛋白均为高表达。脱细胞羊膜负载阴道粘膜干细胞,经过气液界面培养,HE染色见已形成4～5层细胞层,初步构建阴道粘膜上皮,PAN染色呈阳性,透射电镜可见紧密的细胞间桥粒连接,及细胞与基底膜之间的半桥粒结构。
结论:
分选出的α6briCD71dim细胞具有干细胞的特性,脱细胞羊膜负载阴道粘膜干细胞经过气液界面培养,初步构建出类似正常阴道非角质化鳞状上皮。