研究背景帕金森氏病是一种慢性神经系统变性疾病,该病主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元脱失。多巴胺能神经元在控制人体随意运动和调节姿势位置中起着关键作用。迄今为止,药物对帕金森氏病的治疗还极为有限,只能在一定程度上改善症状,不能阻止疾病的进展。因此仍需研究寻找一种新的治疗方法,能够长期有效地控制症状,甚至从根本上治愈帕金森氏病。干细胞是一类有自身再生能力的细胞,可以分化成不同来源的组织,补充损伤及老化的组织细胞,这为治疗帕金森氏病提供了可能的途径。人脐血来源干细胞与其他种类的干细胞相比具有特殊的优势：(1)来源充足(2)不牵涉伦理问题(3)对捐赠者无明显损伤(4)不容易产生移植物抗宿主反应。其中一类新的脐血干细胞种类被称为脐血多能干细胞。这类细胞具有胚胎细胞的特性,有多向分化潜能。脐血多能干细胞在神经系统变性疾病的研究领域已有一定的相关研究,已经证明,通过使用神经生长因子可以诱导其分化为神经元细胞。而全反式维甲酸是已经证明的可以诱导神经细胞形成,轴突生长和促进多巴胺能神经元分化的有效诱导剂。本研究通过采用全反式维甲酸诱导脐血多能干细胞向多巴胺能神经元分化,探索脐血多能干细胞在治疗帕金森氏病中的作用。研究方法1.脐血多能干细胞的制备在捐赠者的新鲜脐带中收集脐带血,加入淋巴细胞分离液分离单个核细胞,加入红细胞分离液分离出红细胞。分离出单个核细胞用无血清培养基培养。2.细胞分化脐血多能干细胞在生长至70%汇合时在神经细胞培养基内分别加入5μmmol/L及10mol/L全反式维甲酸进行培养,并设阴性及阳性对照。诱导12天后检测细胞特异性标记物和多巴胺。3.实时定量PCR采用实时定量PCR技术检测多巴胺神经元特异性标记物的mRNA在细胞内的表达水平。使用Qiagen kit(Valencia, CA)提取细胞总RNA。根据QuantiTect Reverse Transcription kit(Qiangen, Valencia, CA)说明书将总RNA合成为单链cDNA。以ABI Prism7900HT Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, CA)对每例样本进行实时定量PCR检测。基因特异性PCR引物由SABiosciences (Frederick, MD)公司设计并合成。结果以β-actin作为内参。4. Western blot分析为确定多巴胺能神经细胞转录因子的表达情况,我们采用Western blot进行分析。细胞充分清洗后用预冷PBS洗涤,加入裂解液溶解蛋白,离心,蛋白样本与上样缓冲液混合,煮沸。上样,电泳,转膜。分离后的蛋白用脱脂奶粉封闭,分别与Nurrl, Enl和Wntl Abs抗体孵育。以β-actin为内参。5.免疫细胞化学全反式维甲酸处理的脐血多能干细胞及对照组细胞采用4%多聚甲醛固定,用0.5%TritonX100破膜,封闭,分别与抗酪氨酸羟化酶抗体,抗多巴胺转运体抗体,抗神经细胞核抗体,抗角质蛋白酸性纤维抗体,抗βⅢ微管蛋白抗体,抗微管结合蛋白2抗体等一抗孵育。充分清洗后与相应荧光素标记二抗孵育,采集图像并进行分析。6.多巴胺酶联免疫吸附试验采用全反式维甲酸处理12天后检测处理组与对照组多巴胺的释放。细胞弃去培养液,用PBS清洗,分别加入含5.33mmol/L及56mmol/L钾离子的Hank’s平衡盐溶液。5分钟后测定细胞上清液内多巴胺的含量。研究结果1.脐血多能干细胞有向多巴胺神经细胞分化的潜能：脐血多能干细胞由多人的脐带血制备而成。为评估脐血多能干细胞向多巴胺神经元的分化,我们检测了多巴胺特异神经元Nurrl、Wntl和Enl等特异转录因子的表达。实时定量PCR结果显示未处理组中脐血多能干细胞内表达Nurrl, Wntl, and Enl等mRNA。Western blot分析进一步表明三种蛋白均有表达。实时定量PCR也表明脐血多能干细胞内酪氨酸羟化酶mRNA表达水平较低。而酪氨酸羟化酶是催化酪氨酸合成二羟多巴胺的关键酶。这些结果表明脐血多能干细胞有向多巴胺能神经细胞分化的潜能。2.通过全反式维甲酸诱导可使脐血多能干细胞分化为神经元样细胞：通过实验我们评估了两种浓度全反式维甲酸对脐血多能干细胞的影响。5u mol/L与10u mol/L这两种浓度均可以诱导细胞发生形态学的改变,向神经元分化。而全反式维甲酸的浓度越高,则向神经元分化的细胞比例越大。大多数细胞(90%)在经过10μ mol/L全反式维甲酸处理5-8天后表现出典型的神经元的形态,当处理后10-12天,这一变化更加明显,细胞形成更长的分枝状突起。当以5u mol/L全反式维甲酸处理10-12天后有35%细胞分化形成神经元细胞样形态,但形成轴突较短。在神经元培养基对照组中大多数细胞(>95%)没有表现出向神经元细胞的分化。而在无血清培养基内,脐血多能干细胞经过培养后仍然是圆形,无明显形态改变。通过免疫染色显示神经细胞特异性标志物微管蛋白βⅢ、微管结合蛋-2、成熟神经元标志物抗原、胶质细胞标志物角质蛋白酸性纤维等。结果显示全反式维甲酸诱导后90±4%细胞微管蛋白βⅢ、微管结合蛋-2表达明显增强；70±7%细胞经全反式维甲酸诱导后成熟神经元标志物抗原表达阳性；只有少数细胞表达角质蛋白酸性纤维(5±2%)。在神经细胞培养基对照组中约有(5%)细胞表达微管蛋白βⅢ、微管结合蛋-2、成熟神经元标志物抗原、胶质细胞标志物角质蛋白酸性纤维等。这些结果证明通过使用10μ mol/L全反式维甲酸诱导脐血多能干细胞可使其分化成为神经元样细胞。3.经全反式维甲酸诱导后脐血多能干细胞分化成功能性多巴胺能神经元,并刺激后可释放多巴胺：我们通过免疫荧光的方法检测多巴胺能神经元特异性蛋白,包括酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体。结果显示：经全反式维甲酸处理后约48±11%的细胞表达酪氨酸羟化酶；36±9%的细胞表达多巴胺转运体。而在神经培养基血清对照组中仅有少量细胞(5±1%)表达酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体。结果证明通过全反式维甲酸诱导可以使脐血多能干细胞分化成为多巴胺能神经元。通过细胞外钾离子刺激导致细胞去极化,检测经全反式维甲酸诱导后脐血多能干细胞是否会释放多巴胺。通过酶联免疫吸附试验检测结果显示以10μ mol/L全反式维甲酸处理组的细胞,经钾离子刺激后细胞外多巴胺水平显著升高(P<0.001)。结果证明采用10μmol/L全反式维甲酸处理后脐血多能干细胞可以诱导分化为有功能的释放多巴胺的神经元样细胞。结论研究证明通过全反式维甲酸诱导可使脐血多能干细胞分化成为有功能的多巴胺能神经元。这种诱导后产生的脐血多能干细胞来源的神经元表达酪氨酸羟化酶及多巴胺转运体等多巴胺神经元特异性分子标志物,在钾离子刺激下分泌多巴胺。这一结果证明全反式维甲酸诱导脐血多能干细胞,可以为干细胞诱导产生多巴胺能神经元,治疗帕金森氏病提供新的途径。