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研究背景和目的：血管损伤后再狭窄（RS）是一个复杂的过程，新生内膜形成是其主要病理基础，新生内膜的主要成因是血管平滑肌细胞（VSMC）表型发生改变，发生增殖及内膜下迁移。在导致或加重VSMC增殖和迁移诸多因素中，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）所介导的生物学作用是其中重要的因素之一。AngⅡ具有多种生物学作用，其作用的多样性是通过其受体的多样性介导的，目前已确定的AngⅡ受体至少有两型，即AngⅡ1型受体（AT1R）和AngⅡ2型受体（AT2R）。人们所熟知的AngⅡ的大多数生物学作用，包括其促VSMC增殖及内膜下迁移作用，是通过其AT1R所介导的，对AT2R的作用则了解较少。已有的研究提示，AT2R在对血管张力、细胞增殖、迁移等方面都有与AT1R相拮抗的作用，但AT2R主要在动物胚胎发育期表达较强，出生后很快减弱，成年动物仅在脑、卵巢、肾上腺等组织有表达，血管等组织表达较少或不表达，因而对其抑制VSMC增殖、迁移作用在RS中的作用认识较少。在被损伤血管的组织中，AT2R表达较少，AngⅡ主要通过AT1R介导产生促VSMC增殖、迁移的作用，而缺乏AT2R介导的抑制效应，也许是RS发生发展的一个重要因素，增强AT2R在靶血管中的表达可能达到抑制RS的目的。基于这一认识，本研究通过构建AT2R基因的重组腺病毒载体并转染体外培养VSMC，研究其表达及表达后VSMC增殖、迁移和凋亡等生物学行为所受的影响，从而探讨增强AT2R表达在RS发生发展中的作用和意义。 研究方法：用组织块贴壁法培养原代大鼠主动脉血管VSMC用作体外转染表达AT2R的实验平台；用同源重组方法构建携带大鼠AT2R cDNA的复制缺陷型人类5型腺病毒载体，并用293细胞扩增，纯化制取高滴度腺病毒载体转染液，并用常规方法转染体外培养VSMC；AT2R转染VSMC后， 弟三军医大等博士企丈ATZR细胞表达率用流式细胞仪检测，其膜表达、蛋白表达和 mRNA的转录表达分别用免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法和RT干CR法检测；AhR转染表达后对VSMC增殖力的影响分别用细胞分裂指数、细胞增殖周期、MTh法和 5－滨脱氧尿昔6ErdU）掺入法检测；ATZR转染表达后对 VSMC迁移能力的影响用改良Boyden七趋化小室计数迁移细胞数和激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白F七Ctin表达变化的方法检测：ATZR转染表达后对VSMC凋亡用流式细胞仪。原位末端标记法（TUNEL染色法）、及凋亡基因比上、bgy mRNA转录表达检测等方法检测；用不同浓度Angll刺激转染细胞；千预因素选用AT IRfa抗剂（CVngN淖AT ZRfa抗剂PD12刀9人各组均同时检测 ATIR表达变化，分析ATIR和 ATZR表达的关系。 研究结果八1）采用同源重组构建复制缺陷型腺病毒载体技术，成功构建了带 ATZR CDNA的人类 5型复制缺陷型腺病毒重组体一AdCMV－ATZR，纯化制取病毒转染液滴度约SXwi’pf＼II：Ill－－－c经计算其最佳MOI为30；Q）用组织块贴壁法，本实验成功原代培养了大鼠主动脉血管平滑肌细胞，并经免疫组织化学及细胞形态学方法鉴定确认：臼）＊扎MV－ATZ R转染＊S＊C后，通过流式细胞仪、免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法及RT－PCR方法分别检测ATZR细胞表达率、膜表达、蛋白及InRNA表达的结果证明VSMC成功获得ATZR表达，表达率随转染表达时间延长逐渐增加，最高细胞表达率约89．sl％；N）Angll作用对ATZR转染表达无显著影响，ATZR表达对Angll也无显著浓度依赖性；（5）ATZR转染表达对 ATIR表达不产生显著影响，转染表达 ATZR的 VSMC，施加 Angll刺激时 ATIR表达仍明显上调；旧）ATZR表达显著抑制VSMC增殖：与未转染组比较，ATZR峰值表达时，VSMCS期和＊－M期比率由3＊＊％降到1）9％…＜0刀5X细胞分裂指数山刀．＊％降到9石％…＜0刀1），＊h和5Erd掺入量的吸光度检测值分别降低61．＊％和引＊％…0刀1＼（）ATZ R表达明显抑制＊＊＊C迁移。与未转染组比较，AT ZR峰值表达时，＊S＊C迁移细胞数减少6L％（功刀5），细胞骨架蛋白F砒扣表达也显著减少八8）A卫以1刺激可增强AT ZR介导的抑制VS＊C增殖和迁移作用，但这一作用也无显著浓度依赖性；（9）ATZR有显著促VSMC ·Vll· 上 二一 腺病毒介导ADR转基因对血管平滑肌细胞生物学行为影响的研究 凋亡的作用：与未转染组比较，转染组AhR表达48小时其细胞凋亡率由 二．6％增加到32．l％（p＜0＊5），致凋亡的bax mRNA表达增加 76．3％（p＜0．of）， IU’ru－－ L染色也检测到大量＊S＊C凋亡：门0）AT IR和AT ZR i抗剂均对 AhR在VSMC的转染表达无显著影响，ATIR a抗剂对ATZR所介导的抑 制细胞增殖和迁移的作用无明显影响，而ATZR桔