论文部分内容阅读
水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)由介体褐飞虱(Nilaparvata lugens)以持久增殖型方式进行传播,该病毒引起的水稻齿叶矮缩病给水稻生产造成严重危害。为研究RRSV与介体褐飞虱的互作关系,我们利用Illumina HiSeqTM 2500测序平台对未感染病毒的和两个不同感染时间的褐飞虱培养细胞进行转录组的测序。测序结果如下:1.通过测序组装共获得64,888条Unigene序列,其中26,904(41.46%)条Unigene序列的NR比对结果显著。统计同源蛋白的物种来源结果显示,与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)同源的序列最多,占到15.50%;豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)第二,占到 8.31%;第三是体虱(Pediculus humanus corporis),占 7.75%;佛州文昌鱼(Branchiostoma floridae)第四,占 6.31%。2.与未感染RRSV的细胞相比,受该病毒侵染的细胞有1,753个基因表达差异,其中上调表达基因1,280个,下调表达基因473个。受RRSV侵染1天和4天的细胞间存在1,239个差异表达基因,其中上调表达的基因919个,下调表达的基因320个;未受RRSV侵染的细胞和RRSV侵染4天的细胞的差异表达基因1,374个,其中上调表达的基因1,044个,下调表达的基因330个。3.对差异表达基因的GO分类分析结果表明受RRSV侵染1 d与侵染4 d的细胞样本间差异表达基因的GO富集相近。对RRSV侵染1 d和4 d的的褐飞虱细胞的差异表达基因进行生物通路分析,结果显示:MAPK信号通路、PPAR信号通路、cAMP信号通路、Ras信号通路等的基因只在RRSV侵染初期时有差异表达,推测侵染1 d时,褐飞虱细胞启动一系列的反应来对病毒的侵染进行应答;另外细胞中关于抗生素的生物合成,病毒致癌作用,吞噬体,剪接体,溶酶体,黏着连接等基因只在RRSV侵染4 d时表达有差异,推测RRSV对褐飞虱的侵染是致病性的。4.对病毒侵染后持续上调表达的GroupF组中的13个Unigene进行RT-qPCR验证,结果显示10个(76.92%)Unigene与转录组分析的表达趋势一致。根据NCBI非冗余蛋白数据库(NR database)BLASTx(E-value<1.0E-5)对13个Unigene进行功能注释。有两个Unigene可以比对上已知的同源蛋白,分别为s-3.comp41631_c0_seq1对应的意蜂(Apis mellifera)的假设蛋白LOC409594(DNAJC14)和s-3.comp41630_c0_seq1对应的肩胛硬蜱(Ixodes scapularis)的假设蛋白IscW_ISCW005027(ISCW005027)。体外合成这两个基因的dsRNA并转染褐飞虱细胞,结果表明,转染这两个基因都会降低RRSV的积累量。在褐飞虱虫体的干扰实验表明,抑制ISCW005027基因后,褐飞虱带毒率与对照组相比无差别,但病毒量相比对照组上调;而干扰DNAJC14后,褐飞虱带毒率降低,且RRSV积累量相对下调。5.另外,我们将测序序列的拼接结果与病毒基因库进行比对,发现疑似李氏蜘蛛病毒(Lishi Spider Virus,LSV),三峡水黾病毒(Sanxia Water Strider Virus,SWSV),马器质性脑病病毒(Equine Encephalosis Virus,EEV)这三种病毒序列。经检测,确定有这三个病毒的存在。通过体外克隆序列拼接,得到LSV的序列7122 bp,SWSV的序列3153 bp,EEV序列的1075 bp。对实验室的褐飞虱虫体和新培养的细胞进行这三个病毒的检测,均未检测到EEV,推测EEV不是褐飞虱虫体的内源病毒。