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Ezrin是连接细胞膜与细胞骨架的一种多功能蛋白,参与了细胞重塑、细胞粘附、细胞运动、细胞信号转导等多种生物学过程。近年来研究发现,Ezrin与动物的生殖活动关系密切,参与了卵母细胞成熟、早期胚胎发育、精子发生和获能及子宫内膜发育和胚胎着床。我们前期研究发现,不同发育阶段的小鼠卵巢和睾丸组织,以及小鼠不同发育阶段的卵母细胞和早期胚胎均呈p-EzrinThr567抗体染色阳性,但其具体作用目前尚不十分清楚。NSC668394是近年来发现的一种特异性抑制EzrinThr567磷酸化的小分子化合物。本课题以NSC668394为工具,研究EzrinThr567磷酸化在小鼠卵母细胞成熟、受精、胚胎早期发育及性腺发育过程中的作用,对于丰富哺乳动物卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育调控理论具有重要意义。试验包括以下四部分:试验一:NSC668394对小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎发育的影响。将小鼠GV期卵母细胞、体内MII期卵母细胞和原核期胚胎随机分成5组,分别培养于添加0、2.5、5.0、10.0μM的NSC668394和0.1%DMSO的体外培养基中,结果发现体外培养液中添加NSC668394不仅影响卵母细胞成熟率,而且影响到成熟卵母细胞、体内MII期卵母细胞的受精率和后续体外受精胚和原核期胚的早期胚胎发育,其中2.5 u M组的卵母细胞体外成熟率、体外受精率和体内MII期卵母细胞体外受精率显著低于其余各组(P<0.05);10.0 μ组在后续的胚胎发育中绝大部分停滞在2-细胞期,2.5和5.0 μM组的桑椹胚和囊胚发育率显著低于对照组(P<0.05)。试验二:NSC668394所造成的卵母细胞体外成熟、体外受精及体外发育阻滞的挽救试验。将GV期小鼠卵母细胞、体内MII期卵母细胞和原核期胚胎随机分成4组,分别培养于含 0μM(Ⅰ组)、2.5μM(Ⅱ组)NSC668394 或含 0.1%DMSO(Ⅲ组)的体外培养基中,Ⅳ组卵细胞、体内MII期卵母细胞和原核期胚胎显微注射Ezrin T567D的mRNA后培养于添加2.5μM NSC668394的体外培养基,并进行体外受精及体外培养。结果显示:Ⅳ组卵母细胞体外成熟率、体外受精率显著高于Ⅱ组(P<0.05),但显著低于Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.05);Ⅳ组的体内MII期卵母细胞体外受精率和早期胚胎发育率显著高于Ⅱ组(P<0.05),但显著低于Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.05);Ⅳ组的原核期胚胎的桑葚胚和囊胚发育率显著高于Ⅱ组(P<0.05),但显著低于Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.05)。试验三:3腹腔注射NSC668394对小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎发育的影响。3 w龄断奶鼠分别持续腹腔注射NSC668394(试验组)或0.1%DMSO(对照组)至性成熟,比较两组间卵母细胞体外成熟、受精和早期胚胎发育,结果显示,两组间卵母细胞体外成熟率相似,但试验组卵母细胞的体外受精率和体外受精胚的桑椹胚率和囊胚率都显著低于对照组;Western Blot结果显示试验组小鼠睾丸和卵巢上p-Ezrin(Thr567)表达低于对照组。试验四:腹腔注射NSC668394对对小鼠生长速度、性腺发育及Ezrin和p-Ezrin(Thr567)表达定位的影响。分别对妊娠10.5 d的母鼠和3 w断奶期鼠腹腔注射NSC668394(试验组)或0.1%DMSO(对照组),比较两组间小鼠生长速度及性腺发育。结果显示,试验组母鼠所产仔鼠的增重速度对照组,断奶后睾丸精细管直径和厚度显著低于对照组(P<0.05),但两组间雌鼠卵巢组织无明显形态学差异;断奶期注射NSC668394(试验组)的小鼠增重速度显著低于注射0.1%DMSO(对照组)的小鼠,但其睾丸精细管直径和厚度显著高于对照组(P<0.05)。免疫荧光染色发现腹腔注射NSC668394对Ezrin和p-Ezrin(Thr567)表达定位无影响;注射NSC668394对卵巢的发育没有明显影响。结论:培养液中添加NSC668394可降低小鼠卵母细胞体外成熟率、受精率和早期胚胎发育率;显微注射模拟Ezrin Thr567磷酸化的突变体Ezrin T567D的mRNA可挽救由NSC668394造成的小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎发育障碍。孕鼠和断奶鼠腹腔注射NSC668394影响了新生鼠和性成熟鼠的生长速度和性腺发育;腹腔注射NSC668394能显著降低卵母细胞体外受精率以及早期胚胎发育率,但不影响卵母细胞的体外成熟。