【摘 要】
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我国是淡水鱼类养殖大国,大规模、高密度的养殖模式虽然有助于渔民增收并给人们提供价格实惠的食用鱼,但是这种模式也存在使鱼类传染性疾病大爆发的隐患。现有的鱼用免疫制剂大多只对某种或某类病原体感染有作用,随着病毒的变异难以对鱼类产生高效积极的保护效果。因此,开发出一种广谱性的免疫制剂,用于提高鱼类自身免疫力、预防多种病原体感染具有广阔的市场前景。草鱼是我国主要的水产养殖品种。本文以草鱼为实验对象,通过将
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我国是淡水鱼类养殖大国,大规模、高密度的养殖模式虽然有助于渔民增收并给人们提供价格实惠的食用鱼,但是这种模式也存在使鱼类传染性疾病大爆发的隐患。现有的鱼用免疫制剂大多只对某种或某类病原体感染有作用,随着病毒的变异难以对鱼类产生高效积极的保护效果。因此,开发出一种广谱性的免疫制剂,用于提高鱼类自身免疫力、预防多种病原体感染具有广阔的市场前景。草鱼是我国主要的水产养殖品种。本文以草鱼为实验对象,通过将小分子Z-DNA和鱼类特有的蛋白激酶Z（PKZ）构建p CMV-flag载体上制备一种免疫增强剂,每条鱼注射剂量为1μg/g鱼体重。草鱼经腹腔注射若干天后,检测体内Ig M抗体水平的变化情况;取脑、眼、肠、鳃、脾脏、皮肤、肾脏和肝脏组织提RNA并反转录成c DNA,q RT-PCR检测免疫效应基因Ci IFN I（Interferon I）、Ci ISG15（Interferon stimulated gene 15）、Ci PKR（Protein kinase R）、Ci IRF3（Interferon regulatory factor 3）、Ci IRF7（Interferon regulatory factor 7）、Ci TLR3（Toll like receptors 3）和Ci PKZ（Protein kinase Z）在草鱼不同组织中的表达情况;Western blot检测免疫增强剂在不同组织中的分布;检测组织中CAT和SOD活性及MDA含量变化。同时,提取病鱼组织中的病毒,制成GCRV匀浆液,并通过加热和灭活剂处理制备灭活疫苗。最后经免疫增强剂、草鱼出血病病毒灭活疫苗免疫保护15d后进行GCRV攻毒,检测该免疫增强剂保护效果。结果表明:注射免疫增强剂后,草鱼血清中的Ig M表达量逐渐升高,并在第16d表达量达到最高。在体外培养的草鱼肾细胞中,转染Z-DNA-flag和转染Z-DNA-flag/PKZ-flag都能显著上调Ci IFN I的表达。注射免疫增强剂后在草鱼各个组织中大部分基因表达量在第12d达到最高,跟对照组相比差异显著,且在脾、肝、肠、肾的表达水平高于其他组织。酶活力测定结果显示免疫增强剂注射组的SOD、CAT和MDA活性在第8d～12d达到最高,之后逐渐下降,且活性水平显著高于对照组（注射PBS）。蛋白印迹结果显示,第4d在肝、肾、肠、脾、鳃中检测到Z-DNA-flag/PKZ-flag的表达,其余天数也检测到表达,第24d未检测Z-DNA-flag/PKZ-flag的表达。草鱼出血病病毒攻毒结果显示注射免疫增强剂后草鱼的存活率为76%,注射灭活疫苗后草鱼的存活率为53%,未注射免疫增强剂攻毒后草鱼的存活率为21%,注射免疫增强剂组相较于未注射免疫增强剂组的相对保护率达到70%。说明注射免疫增强剂和灭活疫苗对草鱼都能起到保护作用,且注射免疫增强剂效果优于灭活疫苗。
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