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背景与目的支气管哮喘是由多种细胞、细胞因子共同参与的一种异质性气道慢性炎症性疾病。据报道,此病患病率较高,可侵及各个年龄段,不仅严重影响人们的日常生活及工作,还给家庭和社会带来了极大的经济负担。最新研究发现,微小RNA(microRNA,miR)在支气管哮喘的发生发展中起着相当重要的作用。本课题组前期研究也证实了miR-625-5p可通过靶向蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT2)减轻经脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的支气管上皮细胞炎症表现。而本实验旨在体外构建由卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)诱导的支气管哮喘BALB/c小鼠模型,研究miR-625-5p对OVA诱导的支气管哮喘小鼠的影响及其可能的机制。方法1.OVA诱导BALB/c小鼠急性支气管哮喘模型的构建1.1.使用OVA联合氢氧化铝[Aluminium hydroxide,Al(OH)3]凝胶配置致敏液(每1ml致敏液含OVA0.05mg,Al(OH)320mg),以OVA致敏液于第0、7、14天对BALB/c小鼠腹腔注射致敏,第21天起用1%OVA溶液对BALB/c小鼠进行雾化激发支气管哮喘,持续雾化30分钟/天,连续5天,观察雾化时小鼠表现。1.2.在末次雾化激发后24h,处死BALB/c小鼠,行肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞计数分类;酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测总血清免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)E、OVA特异性IgE(OVA specific IgE,OVA-sIgE)及BALF中细胞因子白细胞介素(Interleukin,IL)-4的水平;肺组织苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色观察气道炎症细胞浸润情况。2.miR-625-5p上调对OVA诱导的支气管哮喘小鼠的影响2.1.将20只6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组:正常组(N组)、支气管哮喘组(OVA组)、干扰组(Ago组)及阴性对照组(NC组)。OVA组、Ago组、NC组BALB/c小鼠均于第0、7、14天使用0.2mlOVA溶液(OVA100μg,氢氧化铝凝胶4 mg)腹腔注射致敏,自第21天起用1%OVA溶液对BALB/c小鼠进行雾化,持续雾化30分钟/天,连续5天,激发BALB/c小鼠支气管哮喘发作。Ago组、NC组分别在第20、22、24天在雾化前30分钟尾静脉注射agomiR-625-5p(10nmol/只)和agomiR-NC(10nmol/只)的PBS溶液400μl。N组以等量无菌生理盐水代替相应量的OVA溶液对小鼠进行处理。2.2.在末次雾化激发后24h,使用动物肺功能仪测定不同乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)浓度刺激下BALB/c小鼠的气道阻力(Resistance of Lung,RL);通过肺组织病理切片HE染色观察气道炎症细胞浸润;ELISA法检测总血清IgE、OVA-sIgE及BALF中细胞因子IL-4的水平;显微镜下计数BALF中的细胞总数,再经瑞士吉姆萨染色后行BALF细胞分类计数统计;RT-qPCR法分析各组BALB/c小鼠肺组织中miR-625-5p、IL-6、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)-α的相对mRNA水平变化。2.3.蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测各小组小鼠肺组织AKT2及磷酸化AKT2(phospho-AKT2,p-AKT2)的蛋白表达水平变化。结果1.OVA成功诱导BALB/c小鼠支气管哮喘模型1.1.两组模型小鼠雾化时都表现出抓挠鼻尖、抓耳朵、打喷嚏、活动减少等现象。1.2.哮喘模型小鼠BALF细胞总数、嗜酸性粒细胞数较正常小鼠增加,肺组织HE染色可见明显炎症细胞浸润;以200μl/只致敏液致敏的小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数较0.1ml/只致敏液致敏的小鼠更高,肺组织炎症细胞浸润更明显。2.miR-625-5p对OVA诱导的小鼠哮喘表现有一定的抑制作用2.1.气道阻力:测肺功能时,随Ach激发雾化浓度梯度升高,N组小鼠气道阻力仅有轻微升高;OVA组和NC组小鼠气道阻力升高明显;Ago组气道阻力较OVA组显著下降(p<0.05)。2.2.HE染色:N组小鼠支气管及肺组织结构正常,气道上皮黏膜完整,无纤毛脱落,炎症细胞浸润较少;OVA组和NC组小鼠肺组织切片染色可见气道黏膜明显肿胀,黏膜皱襞明显增多增厚,气道上皮细胞破坏明显,支气管及血管周围有大量炎细胞浸润;Ago组气道炎性细胞浸润较OVA及NC组明显减轻,气道上皮完整,水肿较轻。2.3.ELISA检测:OVA组和NC组小鼠血清总IgE、OVA-sIgE明显高于N组小鼠,Ago组小鼠血清总IgE、OVA-sIgE较OVA组明显降低(p<0.05);较N组小鼠,OVA组和NC组小鼠BALF中细胞因子IL-4的水平增高明显,Ago组小鼠BALF中细胞因子IL-4较OVA组显著下降(p<0.05)。2.4.BALF细胞计数:OVA组和NC组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数显著高于N组,Ago组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数明显低于OVA组(p<0.05)。2.5.WB检测:OVA组和NC组小鼠肺组织p-AKT2的蛋白表达水平明显高于N组,Ago组小鼠肺组织p-AKT2的蛋白表达水平较OVA组明显下降(p<0.05)。结论1.通过OVA成功构建了支气管哮喘小鼠模型,miR-625-5p可降低OVA诱导的支气管哮喘小鼠的气道高反应性,减轻气道炎性细胞浸润。2.miR-625-5p可能通过抑制AKT2磷酸化,从而调控下游细胞因子,最终抑制了OVA诱导的支气管哮喘模型小鼠的气道高反应性及气道炎性细胞浸润。