肥胖被认为是21世纪公共健康的最大威胁,肥胖不仅使患者忍受生活质量和期望值的降低,而且提高了2型糖尿病、心血管疾病、肝的脂肪变性和癌症的发病风险。肥胖相关的胰岛素抵抗是糖尿病等多种疾病起始进程的早期事件,与血脂障碍、高血压、葡萄糖耐受不良和内皮组织功能紊乱相关。大量研究表明,肥胖、胰岛素抵抗患者呈现低水平的炎症反应,慢性炎症是导致胰岛素抵抗的一个重要原因。Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)是模式识别受体Toll样受体家族的一个成员,在病原识别和固有免疫反应中发挥重要作用。最近研究发现,TLR4不仅参与病原微生物入侵的天然免疫应答,许多无菌的炎症导致的疾病,包括肥胖的发生、发展及预后,同样与TLR4信号有关。因此,TLR4在肥胖相关的胰岛素抵抗中的作用值得深入研究。微小RNA(microRNA,mi RNA)是一类进化上高度保守的单链非编码RNA分子,通常由19~22个核苷酸构成。其主要通过抑制靶基因的翻译过程,在转录后水平负性调控基因表达。近几年,国内外学者相继报道miRNAs可以影响体内的多种代谢过程,包括糖脂代谢、胰岛素分泌、细胞分化和炎症反应。一些mi RNAs已被确定在胰岛素作用的靶组织(肝脏、脂肪组织、骨骼肌)中具有重要的生理作用。进一步的研究证实miRNAs不仅存在于细胞内,在细胞外也可稳定存在,且在不同病理状态下,某些血浆mi RNAs水平发生特异性改变,推测血浆mi RNAs检测可能成为疾病早期诊断的新一代生物学标志物。那么,高脂饮食诱导胰岛素抵抗时,血浆mi RNAs表达谱是否发生改变、此改变是否与TLR4信号相关,目前尚不清楚。为此,我们建立了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型,筛选了胰岛素抵抗状态下血浆差异表达的mi RNAs;进一步给予胰岛素抵抗小鼠TLR4抑制剂TAK-242,观察血浆miRNAs表达谱的变化,探讨TLR4、mi RNAs与高脂饮食诱导胰岛素抵抗的关系。本实验首先建立高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型。选取出生21天的雄性c57bl/6小鼠36只,随机分为2组,正常对照组12只,以普通基础饲料喂养(lowfatdiet,lfd),高脂饮食实验组24只,给予高脂饲料喂养(highfatdiet,hfd)。待两组小鼠体重出现显著差异时,进行葡萄糖耐量实验(glucosetolerancetest,gtt)和胰岛素耐量实验(insulintolerancetest,itt),观察小鼠胰岛素抵抗的发生。小鼠胰岛素抵抗模型建立后,观察tlr4抑制剂tak-242对小鼠胰岛素抵抗的作用。lfd组小鼠继续以基础饲料喂养(即作lfd对照组);hfd组小鼠随机分为2组,每组12只小鼠,均继续以高脂饲料喂养,其中一组hfd小鼠腹腔注射tlr4抑制剂tak-242,以0.5mgtak-242/kg体重的计量给予,每周2次(即作给予tak-242的高脂饮食实验组,hfd-t组);另一组hfd小鼠作为单纯高脂饮食的胰岛素抵抗空白对照组(hfd-c组),只给予等体积的溶媒-二甲基亚砜(dmso)。给予小鼠tlr4抑制剂5个月,进行gtt和itt后,处死小鼠。采用edta-k2抗凝管收集血液标本,立即分离外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)和血浆。应用westernblot技术检测pbmctlr4蛋白表达水平。采用全自动生化分析仪测定血浆葡萄糖(glu)、甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、丙氨酸氨基转移酶(alt)的水平。应用小鼠microrna芯片检测血浆mirna表达谱,筛选差异表达的mirnas。应用生物信息学方法,以tlr4及其信号传导通路为中心,预测差异表达mirnas的靶基因,并对靶基因分别进行go和kegg富集分析,以判定差异mirnas主要影响的生物学功能或者通路。结果发现,在小鼠胰岛素抵抗模型建立期间,与对照组相比,高脂饮食组小鼠体重增长较快,喂养至第20周体重出现显著差异(p<0.05);持续高脂饮食7个月,gtt和itt结果显示,高脂饮食组小鼠对糖的调节能力受损、对胰岛素的降糖作用减低,说明高脂饮食组小鼠出现了胰岛素抵抗。出现胰岛素抵抗的小鼠,在给予tlr4抑制剂tak-2425个月后,对葡萄糖的调节能力和对胰岛素的敏感性均有所改善。血浆生化指标结果显示,与对照组比较,单纯高脂组和给予tak-242的高脂饮食组小鼠血浆tg、tc、ldl-c浓度均显著升高(p<0.05),glu、hdl-c、alt水平均有升高趋势,但无统计学意义(p>0.05)。单纯高脂组和给予tak-242的高脂饮食组比较,血浆glu、tg、tc、ldl-c、hdl-c、alt水平在两组之间不存在显著性差异(p>0.05)。westernblot实验结果发现,正常对照组小鼠pbmc未见tlr4蛋白表达,单纯高脂饮食组小鼠pbmc有高水平的tlr4蛋白表达,给予tak-242的高脂饮食小鼠pbmctlr4蛋白虽有表达,但表达量明显低于单纯高脂饮食组小鼠,结果提示tak-242部分抑制了高脂饮食喂养小鼠pbmctlr4蛋白的表达。上述实验揭示,tlr4影响了高脂饮食小鼠胰岛素抵抗状态,抑制tlr4蛋白的表达,有利于改善胰岛素抵抗。microrna基因芯片筛查结果显示,单纯高脂饮食组与正常饮食组比对,筛选出差异显著的mirnas共计185种,其中6种mirnas表达上调,179种mirans表达下调,说明高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠血浆mirna表达谱发生改变。给予tak-242的高脂饮食组与正常饮食组比对,筛选出差异显著的mirans共计171种,均表达下调,表明已产生胰岛素抵抗的高脂饮食小鼠,在给予tlr4抑制剂tak-242后,血浆mirna表达谱与正常饮食组也存在差异。当给予tak-242的高脂饮食组与单纯高脂饮食组比对,筛选出差异表达的mirnas共计13种,均为下调,说明此13种mirnas表达的改变可能与tlr4蛋白表达的部分抑制有关。生物信息学分析结果显示,以tlr4为中心挖掘与其互作的蛋白质,共发现有10种蛋白;在tak-242给予的高脂饮食组与单纯高脂饮食组中差异表达倍数均在1000以上的4种mirnas(mmu-mir-3095-3p、mmu-mir-5113、mmu-mir-709和mmu-mir-335-3p),可在tlr4的互作蛋白质或toll样受体信号通路中找到其作用的靶基因。将这些靶基因进行GO和KEGG分类,发现74%属于生物过程基因,其中转录调控因子占82%。提示TAK-242作为TLR4的抑制剂,可以影响以TLR4信号通路上下游基因及TLR4互作蛋白基因为靶基因的miRNA差异表达。综上,高脂饮食成功诱导了小鼠产生胰岛素抵抗;胰岛素抵抗小鼠血浆miRANs表达谱发生改变;抑制TLR4蛋白的表达可以缓解小鼠胰岛素抵抗状态,且有血浆miRANs表达谱的变化;在TLR4的互作蛋白质或Toll样受体信号通路中存在差异表达显著的miRANs的靶基因。结果提示,胰岛素抵抗发生时,血浆mi RNAs表达谱存在改变,此变化与TLR4及其信号通路相关。该研究结果丰富了胰岛素抵抗发生的机制,为进一步深入研究TLR4、miRNAs在胰岛素抵抗中的作用、及为寻找胰岛素抵抗血浆mi RNAs诊断标志物提供了实验依据。