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组织蛋白酶B(Cathepsin B,CB)是溶酶体半胱氨酸蛋白酶中特殊的一员,既具有内切酶(Endopepdidase)的活性又具有羧基二肽酶(Dipeptidyl carboxypeptidase)的活性。广泛存在水生动物各组织中,不同物种中会有表达差异。CB在卵巢中的高表达表明其在卵巢发育、卵子形成以及胚胎发育中的重要功能,而在受病毒或细菌应激的条件下,血细胞等免疫相关器官中CB的高表达表明其参与到免疫应激的过程中。CB无论在脊椎动物还是无脊椎动物中均起到了关键作用。本课题组前期已通过差异蛋白组学的方法得到日本囊对虾(Marsupenaeus japonicas)卵巢特异表达蛋白CB,并克隆的到了日本囊对虾CB(MjCB)的cDNA全长。在此基础上,采用基因组步移结合常规PCR等方法克隆得到MjCB的基因组全长和5’调控区。采用重组质粒的构建与诱导表达制备出特异的MjCB多克隆抗体。通过日本囊对虾成体RNA干扰实验研究了卵巢发育相关基因在MjCB被干扰情况下,在卵巢组织中的表达情况。本实验还分析了在单侧眼柄切除实验条件下,卵巢组织中相关基因在卵巢中的表达情况。现将主要研究结果总结如下:(1)采用基因组步移(Genome walking)与常规PCR结合的方法,首次克隆得到MjCB的基因组全长3122 bp,由四个外显子和三个内含子组成,第一个外显子只有20 bp,第一个内含子长达1440 bp,内含子的剪切遵循典型的“GT-AG”规则,翻译起始密码子ATG位于第二个外显子中。(2)运用生物信息学软件对5’调控区进行分析,预测出可能存在的核心启动子区和转录起始位点,一个CpG岛,Oct-1、F-kappaB、SP1、AP-1、GATA-1等29个转录因子结合位点。(3)采用His和GTS双标签的方法,成功构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2-MjCB,并诱导其大量表达,成功复性为可溶性的蛋白,纯化后制备出可用于Western Blot检测的特异的多克隆抗体。(4)通过实时荧光定量PCR(Quantitive Real-time PCR,qPCR)的方法研究MjCB在卵巢发育至II期的日本囊对虾不同组织中的表达情况,结果显示MjCB只在此发育阶段的卵巢组织中高表达,与其它组织相比差异极显著(P<0.01)。(5)通过体外重组制备长约400~650 bp的双链RNA片段(Double Stranded RNA,dsRNA)作为干扰片段用于MjCB的RNA干扰实验,采用qPCR来确定MjCB在干扰后0h、6 h、12 h、24 h和48 h卵巢组织中的表达情况,进而确定最佳干扰时间点为12 h。(6)在干扰实验相关基因的研究中,我们采用了2个对照组,即注射dsEGFP组和注射生理盐水组,对照组之间可以相互矫正以确保实验数据的可靠性。在CB下调的情况下,我们采用qPCR的试验方法发现,卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)基因表达显著下调(P<0.05)、组织蛋白酶C(Cathepsin C,CC)基因显著上调(P<0.05)、组织蛋白酶L(Cathepsin L,CL)基因未受到影响(P>0.05)。(7)在单侧眼柄切除组中,CB基因显著下调(P<0.05),Vg、CC和CL基因的表达与对照组相比差异不显著(P>0.05)。