【摘 要】
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目的神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体瘤,20-30%的NB患儿存在MYCN基因扩增,后者被证实与NB的恶性进展和患儿的不良预后密切相关。外泌体携带miRNAs在疾病进展过程中的调控作用被越来越多的研究关注。因此,本研究将探讨MYCN基因扩增的NB细胞来源的外泌体能否通过携带致癌miRNAs作用于非MYCN基因扩增的NB细胞,进而促进后者的增殖和迁移。方法使用实
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目的神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体瘤,20-30%的NB患儿存在MYCN基因扩增,后者被证实与NB的恶性进展和患儿的不良预后密切相关。外泌体携带miRNAs在疾病进展过程中的调控作用被越来越多的研究关注。因此,本研究将探讨MYCN基因扩增的NB细胞来源的外泌体能否通过携带致癌miRNAs作用于非MYCN基因扩增的NB细胞,进而促进后者的增殖和迁移。方法使用实时荧光定量PCR法（RT-q PCR）比较MYCN扩增的SK-N-BE（2）和非MYCN扩增的SH-SY5Y细胞中miR-17-92和PTEN的表达量;转染miR-17-5p模拟物或抑制物来增加或降低miR-17-5p的表达;CCK8、平板克隆实验和Transwell实验验证miR-17-5p对SH-SY5Y细胞增殖活力和迁移能力的影响;生物信息学的方法预测miR-17-5p的靶基因,荧光素酶报告实验验证两者的结合关系;RT-q PCR和Western-Blot（WB）检测过表达和下调miR-17-5p的表达后其靶基因的表达变化。差速超速离心法对细胞培养上清液中的外泌体进行分离,纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和WB对外泌体的大小、形态和标志蛋白进行鉴定;将提取的SK-N-BE（2）细胞来源的外泌体和SH-SY5Y共培养;RT-q PCR检测共培养组和对照组SH-SY5Y细胞中miR-17-5p的表达量差异,CCK8、平板克隆实验和Transwell实验验证SK-N-BE（2）细胞来源的外泌体对SH-SY5Y细胞增殖和迁移能力的影响,WB检测外泌体共培养组和对照组SH-SY5Y细胞中miR-17-5p靶基因及下游通路的蛋白水平的变化。结果miR-17-92基因簇在MYCN基因扩增的SK-N-BE（2）中的表达显著高于SHSY5Y细胞,而PTEN则显著低表达（p<0.01）。转染miR-17-5p模拟物或抑制物可提高或下调SH-SY5Y中miR-17-5p的表达,差异具有统计学意义（p<0.001）。细胞功能学实验表明过表达或下调miR-17-5p可促进或抑制SH-SY5Y的增殖和迁移,差异具有统计学意义（p<0.05）。此外,双荧光素酶报告基因检测结果发现与NC模拟物组相比,miR-17-5p模拟物组PTEN-wt的荧光素酶活性受到明显抑制（p<0.01）。WB结果也进一步证实,在miR-17-5p模拟物组细胞中的PTEN蛋白水平显著降低,p-Akt/Akt比值显著增加（p<0.05）。TEM结果显示提取的外泌体具有典型的杯状结构,并被一层磷脂膜所包被,直径为50～150 nm。NTA结果表明外泌体的粒径大小在50～150 nm处达到峰值。此外,Western-blot结果发现外泌体的标志蛋白（位于外泌体内部蛋白TSG101和四跨膜蛋白分子CD63）均富含于外泌体。而在和SK-NBE（2）细胞来源的外泌体共培养后,SH-SY5Y细胞的增殖和迁移能力显著增强（p<0.01）,细胞内miR-17-5p的表达显著增加（p<0.01）,PTEN的表达量明显降低而p-Akt/Akt比值则明显上调（p<0.05）。结论我们的研究发现miR-17-5p在MYCN基因扩增的NB中的高表达,miR-17-5p能靶向下调PTEN的表达,进而激活PI3K/Akt信号通路来促进NB细胞的增殖和迁移,研究进一步发现SK-N-BE（2）细胞来源的外泌体能通过传递miR-17-5p进入SHSY5Y细胞,并可能通过上述促癌机制来影响SH-SY5Y细胞的增殖和迁移。
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