慢性心力衰竭是一个影响全球的公共卫生问题。随着现代医学技术的发展,一系列心血管治疗药物广泛应用于临床,心血管疾病的死亡率已经得到了一定的控制,然而疾病一旦进展成心衰,死亡率依然高企。我国人口的老龄化进程加快,患有高血压、冠心病等人数巨大,成为了潜在的心衰患病人群,加重我国医疗负担。因此,深入认识心衰的发病机理,研发有效防治心衰的药物,是防治慢性心力衰竭的重中之重。近年来能量代谢调节疗法成为了防治心衰的热点,通过改善线粒体功能及心肌能量代谢,能够延缓心室重构进程,提高心功能。然而目前改善心脏能量代谢的药物依然存在诸多局限性,难以整体兼顾心衰复杂的病理变化。中医药重视整体辨证和调节,中药复方中蕴含多种活性物质表现出来的多靶点、多途径整合作用,在防治慢性心力衰竭这类复杂性病变具有较大优势,中药复方治疗心衰也逐渐得到了国际社会的认可。现代中医界对心衰病因病机的认识趋于一致,认为心衰的基本病机是本虚标实,本虚表现为心气、心阳亏虚,标实表现为血瘀、痰饮、水湿等,病机关键在于心气阳虚衰,无力行气运血。益气活血利水,成为了当前众医家治疗心衰的基本大法。暖心康,是在益气活血利水法指导下,由本课题组团队通过根据大量的临床经验和基础研究数据,通过组方精简优化而成的代表方,在慢性心衰的临床应用中已取得了良好的效果。本论文主要研究益气活血利水代表方暖心康对慢性心衰能量代谢重构的作用及机制。目的:探讨益气活血利水法代表方暖心康治疗慢性心力衰竭的疗效后,通过组学结合网络药理学方法,预测暖心康调控心衰能量代谢方面的潜在机制和物质基础,最后通过实验验证暖心康对能量代谢重构的作用,并围绕ADRA1A-AMPK信号轴探讨暖心康改善能量代谢重构的机制。方法:1.建立小鼠主动脉缩窄致心衰模型,假手术组为对照,对手术后小鼠分别给予生理盐水、暖心康及曲美他嗪的药物干预,给药6周后采用超声心动图测定小鼠心脏功能,测量心重比评估心肌肥大的程度,Masson染色法测定心脏心肌纤维化程度,TUNEL染色法测定心肌细胞凋亡程度,荧光定量PCR法测定心脏ANP、BNP含量,以此综合评估暖心康对慢性心力衰竭心功能和心室重构的影响。2.对Sham,TAC,NXK组小鼠心脏提取总RNA,进行全转录组测序;对TAC、NXK组小鼠血清进行非靶向代谢组测序,采用Omicsnet综合转录组学和代谢组学的结果,构建慢性心力衰竭能量代谢相关的上游差异基因和下游代谢物网络。3.通过UHPLC-MS法与数据库、文献比对,鉴定暖心康中有效活性物质;再运用网络药理学方法,构建“暖心康有效成分-靶点-通路”网络,分析暖心康重要的活性物质和关键靶点、信号通路;使用荧光定量PCR法对网络药理学与转录组学重合的靶点进行验证,选择靶点肾上腺素受体alpha 1a(Adrenergic receptor alpha 1a,ADRA1A),构建ADRA1A蛋白模型,与暖心康鉴定出来的21种活性化合物分别进行分子对接模拟。4.通过试剂盒测定各组小鼠心脏总ATP水平,试剂盒检测NAD+/NADH比值评估线粒体电子链产能效率,并通过透射电镜观察各组心脏线粒体的结构,荧光定量PCR法测定各组心脏中PGC-1 α 的表达。通过提取各组小鼠原代心肌细胞,分别进行Mitotraker、MitoSox染色以观察心肌细胞中线粒体、ROS的表达情况。采用暖心康含药血清处理缺氧H9c2心肌细胞,Seahorse能量代谢仪检测心肌细胞中线粒体呼吸功能。最后采用荧光定量PCR法测定各组心脏组织在不同时间点的糖脂相关转运酶CPT-1,GLUT4和MPC1的表达,以观察暖心康是否优化糖脂能量底物的使用效率。5.建立缺氧H9c2心肌细胞模型,运用Western-Blot法检测相关指标的蛋白表达水平,运用荧光定量PCR法检测相关指标的mmRNA水平,试剂盒检测ATP生成能力。分别给予ADRA1A过表达、ADRA1A敲减和ADRA1A过表达并抑制AMPK信号干预条件,观察在缺氧心肌细胞中,ADRA1A对AMPK信号通路的影响,对心肌细胞总ATP生成能力和线粒体生成能力的影响,以及对AMPK信号下游糖脂能量底物利用的影响;然后对该缺氧心肌细胞模型给予暖心康含药血清或对照血清的干预,观察分别在ADRA1A阻断或AMPK信号抑制时,暖心康是否依旧能发挥对心肌细胞的保护作用,该条件下心肌细胞总体ATP生成能力、线粒体生成能力和糖脂能量底物利用的切换是否发生相应的改变。结果:第一部分 暖心康对慢性心力衰竭心功能及心室重构的作用1.低剂量组暖心康只显著升高LVFS、LVESD(P<0.01,P<0.05),对LVEF、SV均未表现出明显的改变(P>0.05,P>0.05,);中、高剂量的暖心康都能能显著升高LVEF(P<0.001,P<0.001),LVFS(P<0.001,P<0.001),显著下调 LVESD(P<0.001,P<0.001),中剂量暖心康能提高SV(P<0.05),而高剂量的暖心康对SV的改善作用更明显(P<0.01)。2.高剂量的暖心康能明显降低衰竭心脏的心重比(P<0.05)。3.暖心康和曲美他嗪都能明显改善慢性心力衰竭小鼠心肌纤维化程度(P<0.05)。暖心康的对心肌纤维化的改善效果比曲美他嗪的更明显。4.暖心康能够显著降低慢性心力衰竭小鼠心肌细胞凋亡比率(P<0.001)。暖心康的对细胞凋亡的改善效果比曲美他嗪的更明显。5.暖心康能够改善慢性心力衰竭小鼠心脏的ANP、BNP转录水平表达(P<0.001),暖心康的对神经内分泌激素环境的改善效果比曲美他嗪的更明显。第二部分 暖心康对慢性心力衰竭能量代谢作用的组学研究1.暖心康改变的生物学过程与心衰过程中发生改变的过程十分类似,包括对凋亡的调节过程、细胞外基质形成、对缺氧的反应、线粒体形成、ATP分解等。2.暖心康对慢性心力衰竭小鼠心脏能量代谢方面的调控可能集中在ATP分解代谢、线粒体组织、线粒体呼吸电子链、糖脂代谢、线粒体膜电位、线粒体钙稳态和线粒体凋亡改变等生物学过程,ATP结合、蛋白结合、锌离子结合等分子功能,线粒体膜、线粒体呼吸链复合物,线粒体合成酶,线粒体丙酮酸脱氢酶等细胞组分发生调控。3.PI3K-AKT、Notch、FoxO、cAMP、MAPK、心肌细胞的肾上腺素信号和AMPK等多个信号通路都参与暖心康对慢性心力衰竭的调控过程中。4.暖心康能够显著改变慢性心力衰竭小鼠血清的代谢微环境,综合上游转录组学差异基因和下游代谢组学代谢物分析发现,暖心康作用下的能量代谢相关差异基因重点调控的代谢物为二磷酸腺苷(AMP)。第三部分 暖心康对慢性心力衰竭能量代谢作用的网络药理学研究1.鉴定出暖心康内含包括20(R)-人参皂苷Rg3等21种有效成分。2.分析“暖心康有效成分-重要直接靶点-重要通路”网络的关键节点,得到暖心康的关键有效成分包括20(R)-人参皂苷Rg3、人参皂苷Rs3、三七皂苷H、毛冬青皂苷A1、竹节参皂苷V、人参皂苷Rd和人参皂苷Rs6。关键直接靶点包括MAPT、STAT家族基因(STAT1～STAT4)、CHRM2 和 CHRM3,以及 BCL2 家族基因(BCL2、BCL2L1、BCL2L2)。对关键信号通路包括:PI3K-AKT信号通路、RAS信号通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路、钙信号通路和肾上腺素能信号通路。结果提示了表明这些有效成分、靶点和信号通路可能高度参与暖心康的作用机制。3.得到14个转录组学差异基因和网络药理学方法预测的关键靶点交集基因,其中 Bcl2,Bc1211,Chrm2,Adoral,Statl,Mme,Ctss,Dct,Hpse,Hsd11b1,Adrala,Metap2和Ppm1b等13个靶点的表达水平在小鼠心脏中得到验证。4.选取能量代谢相关基因ADRA1A作为关键靶点,通过Swiss Model模拟得到了ADRA1A蛋白结构蛋白,与暖心康的21种有效成分分别进行分子对接模拟,得到有6个潜在的有效成分与ADRA1A相互作用,分别是:人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd),人参皂苷 Re(Ginsenoside Re),人参皂苷 Rs3(Ginsenoside Rs3),三七皂苷 H(Notoginsenoside H),吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid),棉子糖(Raffinose)。第四部分 暖心康对慢性心力衰竭线粒体能量代谢重构的作用1.暖心康能显著提升慢性心力衰竭小鼠心脏的ATP产量(P<0.001)。2.暖心康能提高慢性心力衰竭小鼠心脏线粒体的NAD+/NADH 比值(P<0.05)。提高慢性心力衰竭小鼠心脏的PGC-1 α表达水平(P<0.001)。明显改善慢性心力衰竭小鼠心脏线粒体的超微结构。提高原代心肌细胞线粒体的表达丰度。减少原代心肌细胞线粒体ROS的含量。3.暖心康含药血清能够显著降低H9c2心肌细胞线粒体的BR(P<0.001),MR(P<0.01),PL(P<0.001)和 NMR(P<0.01),并且能显著提升 ATP(P<0.05)和 CE(P<0.01),对SR则没有明显改变。4.暖心康显著改变心衰小鼠心脏中CPT-1,GLUT4,MPC1转录表达水平,随时间动态变化。第五部分 暖心康对慢性心力衰竭能量代谢重构作用的机制研究1.ADRA1A-shRNA能够敲低心肌细胞中ADRA1A蛋白的表达水平。Compound C能够抑制心肌细胞中AMPK α蛋白磷酸化。2.ADRA1A在缺氧条件下能刺激H9c2心肌细胞AMPK α蛋白磷酸化表达增高,ADRA1A在缺氧条件下能增加H9c2心肌细胞ATP含量(P<0.05),AMPK抑制剂可以阻断ADRA1A激动对ATP的提升作用,使心肌细胞总ATP产量显著下降(P<0.05),与对照组相比约减少47%ADRA1A可以显著提高H9c2心肌细胞的PGC-1 α,GLUT4和MPC1的转录水平表达(P<0.05,P<0.05,P<0.05),并能显著降低CPT-1的表达(P<0.05),AMPK抑制剂能够部分或完全阻断ADRA1A激活对PGC-1 α,CPT-1,GLUT4和MPC1所产生的影响(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05)。3.暖心康能增加慢性心力衰竭小鼠心脏的ADRA1A蛋白表达和AMPK α蛋白磷酸化。4.暖心康含药血清能够明显增加H9c2心肌细胞中ADRA1A蛋白和AMPK α蛋白磷酸化水平,能够显著升高H9c2心肌细胞的ATP产量(P<0.001),能够显著提高H9c2心肌细胞的PGC-1α,GLUT4和MPC1的转录水平表达(P<0.05,P<0.05,P<0.05),并能显著降低CPT-1的表达(P<0.05)。加入AMPK抑制剂或ADRAlA-shRNA后,暖心康组与对照组的ATP含量无显著差异(P>0.05)。加入AMPK抑制剂后,暖心康组和对照组的PGC-1α,CPT-1,GLUT4和MPC1的转录水平表达则无显著差异(P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05)。加入ADRA1A-shRNA后,暖心康组和对照组H9c2心肌细胞的PGC-1α,CPT-1和MPC1的转录水平表达无显著差异(P>0.05,P>0.05,P>0.05),而ADRA1A敲低甚至进一步降低暖心康组H9c2心肌细胞的GLUT4的表达(P<0.05)。结论:1.中、高剂量的暖心康能够改善慢性心力衰竭小鼠心功能,其中高剂量对慢性心力衰竭心肌肥大的改善效果更好。暖心康能够显著改善衰竭心脏的心肌纤维化程度,减少心肌细胞凋亡,改善神经内分泌激素环境,且较曲美他嗪对照组有更明显的效果。2.暖心康可能作用与心衰发病的病理途径来治疗慢性心力衰竭。暖心康能够广泛影响线粒体的组分、功能和能量代谢环境,同时能够调节糖脂底物代谢和ATP生物合成,很可能通过这些途径对能量代谢重构产生调控。暖心康能影响衰竭心脏中多条信号通路。AMPK信号通路可能在暖心康对衰竭心脏能量代谢重构的调控中起重要作用。3.暖心康包括21种有效活性成分,网络药理学分析从另一个维度进一步证实了暖心康存在潜在的多靶点多通路调控机制。暖心康可能通过其中6种重要有效成分激活 ADRA1A。4.暖心康能显著提升慢性心力衰竭小鼠心脏的能量供应,改善衰竭心脏中线粒体电子链供能效率,提升衰竭心脏中线粒体生成能力,改善衰竭心脏中线粒体的超微结构。暖心康能够改善小鼠原代心肌细胞线粒体的含量,改善慢性心力衰竭小鼠心脏心肌细胞线粒体氧化应激的程度。暖心康能够改善心肌细胞在缺氧情况下线粒体的能量供应总量和产能效率,降低线粒体耗氧量,并不会伴随线粒体潜能的改变和糖酵解等无线粒体呼吸总值的增加。暖心康能动态调控慢性心力衰竭进展中,心脏对糖脂能量代谢底物的利用,其底物利用模式从对脂肪酸的有氧氧化或葡萄糖的糖酵解,更多地转变为对葡萄糖的有氧氧化。上述结果统一表明,暖心康可能通过改善线粒体的数量、质量、呼吸功能,和对慢性心力衰竭小鼠心脏中能量代谢底物的优化,总体上实现对衰竭心脏能量代谢重构的改善作用。5.ADRA1A可以通过调控AMPK信号通路,提高心肌细胞在缺氧情况下的ATP生成和对糖脂能量代谢底物的切换。暖心康通过激活ADRA1A-AMPK信号轴,提高心肌细胞在缺氧情况下的ATP生成和对糖脂能量代谢底物的切换,从而改善心肌细胞能量代谢重构的进程。