重症休克是休克病程的最后阶段,出现难以治疗的微循环衰竭、顽固性低血压和多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS),是目前世界范围内致死致残的主要疾患之一。因此,查明重症休克的发生发展机制并寻求及时有效的治疗手段具有重要意义。前期研究表明,线粒体结构和功能障碍是急性休克晚期一个体内普遍存在的现象,参与了重症休克难治期(微循环衰竭期)的发生和发展,是导致血管低反应性和顽固性低血压的重要机制之一。线粒体保护剂虎杖苷(polydatin,PD),白藜芦醇(resveratrol,Res)和环孢霉素A(Cyclosporin A,CsA)可保护线粒体的结构和功能从而改善血管反应性和平均动脉压(mean blood pressure,MAP),延长动物生存时间。因此,防治血管平滑肌细胞线粒体功能不全将成为重症休克治疗的新靶点。线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)是线粒体内膜上的一个多蛋白复合体,其分子结构尚不明确。目前多数学者认为位于外膜上的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC),内膜上腺嘌呤核苷转位蛋白(adenine nucleotide translocase,ANT)和基质中的亲环素D(cyclophilinD,CypD)对mPTP的开放具有重要调控作用。在正常生理状态下,mPTP处于瞬间开闭的动态平衡,氧化应激、胞内钙超载等因素可导致mPTP持续性开放,允许<1.5kDa的小分子物质和水分从线粒体透出进入胞质,而大分子的蛋白不能透出,进而引起线粒体基质内胶体渗透压升高,吸引水分进入线粒体,带来线粒体肿胀,嵴破坏等病理性损坏。因此,mPTP的持续开放是诱发线粒体功能障碍的关键环节。亲环素D是mPTP结构中的一个重要调节靶点,近年来研究表明CypD的乙酰化可增强其与线粒体内膜上腺嘌呤核苷转位蛋白ANT的亲和力,进而促进mPTP的开放。沉默信息调节因子2(Silent information regulator 2,Sir2)是首先在酵母中发现的依赖于烟酷胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotin Amide Adenine Dinucleotide,NAD)的第三类组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases,HDACs),在哺乳动物中其家族共有七位成员(SIRT1--SIRT7)。其中SIRT1是与哺乳动物同源性最高的家族成员,研究表明SIRT1激活可增加线粒体的生物合成和能量代谢,增强细胞对抗氧化应激反应的能力;SIRT3是线粒体上最主要的去乙酰化酶,通过调控各种线粒体蛋白的乙酰化修饰,进而影响线粒体的功能。目前普遍认为白藜芦醇是SIRT1的激动剂,我们的前期研究证实白藜芦醇可抑制重症休克时肠系膜小动脉平滑肌细胞(arterial smooth muscle cells,ASMCs)mPTP的开放,保护线粒体的功能,有利于恢复血管反应性,但目前关于重症休克时SIRT1对小动脉平滑肌细胞线粒体功能的影响,SIRT1和SIRT3在重症休克时调控血管低反应性的作用及其机制尚未见报道。由此我们提出假设,重症休克时,SIRT1活性变化通过调控血管平滑肌细胞线粒体蛋白CypD的乙酰化进而带来mPTP的开放,引起线粒体损伤和血管平滑肌反应性低下。基于以上假设,本研究联合采用在体复制大鼠重症失血性休克模型和体外小动脉平滑肌细胞缺氧复氧模型,探讨SIRT1调控血管平滑肌细胞线粒体通透性转变孔的信号通路及其在重症失血性休克线粒体损伤中的作用和机制。本论文主要包括了以下三个部分研究内容:第一部分:SIRT1介导重症失血性休克大鼠血管、平滑肌细胞线粒体结构损伤和功能障碍第二部分:SIRT1调控重症休克血管平滑肌细胞线粒体通透性转变孔开放的机制第三部分:SIRT1激动剂保护重症休克血管平滑肌细胞线粒体和恢复血管反应性第一部分:SIRT1介导重症失血性休克大鼠血管平滑肌细胞线粒体结构损伤和功能障碍研究目的:在体复制重症失血性休克大鼠模型,探讨重症休克过程中SIRT1和SIRT3的变化与血管平滑肌细胞线粒体结构和功能障碍之间的相关性。研究方法:1.Wistar大鼠随机分为6组:假手术组(0 min),休克(hemorrhagic shock,HS)60 min(HS60 min)组,休克 120 min(HS 120 min)组,回输血 10 min(RI 10 min)组,回输血60 min(RI 60 min)组和回输血 120 min(RI120 min)组,复制重症失血性休克模型,并在休克的不同时间点收集肠系膜动脉小血管,用于后续实验。2.利用Western blot技术和去乙酰化酶活性检测试剂盒分别检测重症休克过程中血管组织SIRT1和SIRT3的表达和活性变化,采用细胞免疫荧光技术检测重症休克血管平滑肌细胞SIRT1和SIRT3的空间定位情况和荧光强度的变化,以及CypD的乙酰化。3.采用电子显微镜和流式细胞技术检测重症休克不同时间点血管平滑肌细胞线粒体超微结构、氧化应激以及线粒体通透性转变孔的开放情况,采用萤光素-萤光素酶生物发光法检测平滑肌细胞内ATP含量的变化,进而综合分析重症休克时SIRT1/3的活性和蛋白表达变化与线粒体的结构和功能损伤之间的相关性。4.统计学分析:实验数据以均数±标准差(χ±s)表示。采用SPSS13.0软件进行分析,不同时间点各组之间的差异使用单因素方差分析(oneway ANOVA)后进行多重比较检验,方差齐时用LSD法,方差不齐时用Welch法校正,采用Dunnett’sT3进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.重症休克过程中SIRT1和SIRT3的去乙酰化酶活性的变化在不同时间点之间存在显著性差异(F值分别为6.100和5.377,P值分别为0.001和0.002)。SIRT1和SIRT3的活性在休克60min开始出现显著下降(P<0.001)。回输血后120min,SIRT1和SIRT3的蛋白表达显著降低,不同时间点之间存在显著性差异(F值分别为3.846和2.848,P值分别为0.015和0.046)。与假手术组相比,SIRT1和SIRT3的蛋白表达分别下降了42.25±6.06%(P=0.002)和40.67±4.08%(P=0.002)。细胞免疫荧光实验也证实了在回输血后120 min SIRT1和SIRT3的蛋白表达下调,CypD乙酰化水平增加,核内SIRT1和线粒体SIRT3的分布明显减少。2.重症休克过程中,血管平滑肌细胞线粒体超微结构的损伤从休克120 min开始出现进行性加重,Flameng评分显示不同时间点之间存在显著性差异(F=77.189,P<0.001)。电镜下观察到假手术组的平滑肌细胞线粒体呈椭圆形或圆形,线粒体的嵴排列整齐,内外膜结构完整,基质电子密度均匀。休克120 min开始出现线粒体的肿胀,嵴排列紊乱,回输血后逐渐出现进行性加重的线粒体损伤,线粒体呈空泡状,嵴断裂轮廓不清,内外膜结构破损严重,大部分线粒体完整性丧失。3.重症休克过程中,血管平滑肌细胞内ROS水平从休克120 min开始出现显著升高。不同时间点细胞内ROS水平之间存在显著性差异(F=34.013,P<0.001),与假手术组相比,休克120 min血管平滑肌细胞内的ROS增加了 48.12±10.13%(P=0.035),回输血后 10minROS 增加了 88.04±18.67%(P=0.005),回输血后60min比和120min分别增加了120.91±26.29%(P=0.001)和152.71±24.20%(P<0.001)。4.重重重症休克过程中,血管平滑肌细胞线粒体的钙黄绿素平均荧光强度从回输血后10 min开始显著降低,提示通透性转变孔开放,不同时间点之间差异具有显著性(F=6.946,P<0.001)。在回输血后10min、60min和120min,钙黄绿素的平均荧光强度较假手术组分别下降了 29.94±9.12%(P=0.001)、23.15±8.53%(P=0.011)和 45.29±7.16%(P<0.001)。5.重症休克过程中,不同时间点血管平滑肌细胞线粒体膜电位下降的细胞数之间存在显著性差异(F=10.667,P<0.001)。血管平滑肌细胞的线粒体膜电位从休克120 min开始出现显著下降。在休克过程中,线粒体膜电位降低的细胞数与假手术组相比分别增加了 62.35±22.65%(休克 120 min,P=0.005)、88.34±45.64%(回输血后 10min,P<0.001)、66.84±28.14%(回输血后 60min,P=0.003)和 133.56±15.89%(回输血后 120min,P<0.001)。6.重症休克过程中,血管平滑肌细胞内ATP含量从休克120 min开始出现显著下降(P<0.001),不同时间点细胞内ATP含量之间存在显著性差异(F=17.392,P<0.001)。在休克过程中,细胞内ATP含量与假手术组相比分别下降了 34.37±10.59%(休克 120min)、26.52±4.57%(回输血后 10min)、31.47±2.39%(回输血后600min)和49.30±5.36%(回输血后120min),各组P值均<0.001。第二部分:SIRT1调控重症休克血管平滑肌细胞线粒体通透性转变孔开放的机制研究目的:采用体外培养的人小动脉平滑肌细胞缺氧复氧模型模拟在体重症失血性休克缺血再灌注损伤,探讨SIRT1调控血管平滑肌细胞线粒体通透性转变孔开放的机制。研究方法:1.复制体外培养的人小动脉平滑肌细胞缺氧复氧模型,采用Western blot,CoIP等技术检测SIRT1/3在缺氧复氧时人小动脉平滑肌细胞中的表达以及CypD的乙酰化水平。2.采用慢病毒质粒转染人小动脉平滑肌细胞过表达SIRT1,明确SIRT1过表达对缺氧复氧时平滑肌细胞CypD乙酰化水平的影响。在此基础上,采用siRNA干扰技术下调人小动脉平滑肌细胞SIRT3,以探讨SIRT3在SIRT1调控平滑肌细胞CypD乙酰化水平中的作用。3.为进一步明确缺氧复氧时,过表达SIRT1对SIRT3活性的调控,采用siRNA干扰技术下调人小动脉平滑肌细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-y coactivator 1α,PGC1α)的表达,同第一部分检测过表达SIRT1对缺氧复氧处理后人小动脉平滑肌细胞SIRT3去乙酰化酶活性的影响。4.统计学分析:实验数据的处理和分析同第一部分。研究结果:1.重组SIRT1过表达慢病毒载体感染人小动脉平滑肌细胞后,荧光显微镜下检测到GFP阳性的细胞数约占90%以上;Western blot结果进一步证实,不同处理组之间的差异具有显著性(F=62.712,P<0.001),慢病毒感染人小动脉平滑肌细胞后SIRT1的表达水平较对照组约增加了 4.8倍(P<0.001)。2.SIRT3介导SIRT1对人小动脉平滑肌细胞线粒体蛋白CypD乙酰化水平的调控。与对照组相比,缺氧复氧时CypD的乙酰化水平显著增加;过表达SIRT1可降低CypD的乙酰化水平,而过表达SIRT1的同时下调SIRT3则可逆转CypD乙酰化水平的下降,提示SIRT1通过调控SIRT3的活性进而影响CypD的乙酰化水平。3.PGC1α参与缺氧复氧时人小动脉平滑肌细胞SIRT1对SIRT3去乙酰化酶活性的调控。各不同处理组之间的差异具有显著性(F=13.154,P<0.001)。缺氧复氧处理后SIRT3的去乙酰化酶活性较对照组下降了 46.34±7.50%(n=6,P<0.001),而过表达SIRT1可部分恢复SIRT3活性,较缺氧复氧组约增加了36.11 ±9.40%(n=6,P<0.001)。过表达SIRT1的同时下调PGC1α的表达可部分抑制SIRT3的活性,较单独SIRT1过表达组下降了19.56±6.08%(n=6,P=0.023)。提示PGC1α参与了 SIRT1对SIRT3活性的调控。第三部分:SIRT1激活剂保护重症休克血管平滑肌细胞线粒体和恢复血管反应性研究目的:复制重症失血性休克模型,查明SIRT1激动剂SRT1720、白藜芦醇和虎杖苷对重症休克时血管平滑肌细胞线粒体结构和功能,血管反应性和平均动脉压以及休克大鼠存活时间的影响。研究方法:1.实验分为8组:假手术组(sham),溶剂对照组(shock),白藜芦醇治疗组(Res),SIRT1激动剂SRT1720治疗组(SRT),虎杖苷治疗组(PD)以及在SIRT1抑制剂Ex527+白藜芦醇组(Ex+Res),Ex527+SRT1720组(Ex+SRT)和Ex527+虎杖苷组(Ex+PD)。假手术组只进行麻醉和股动静脉插管,同第一部分复制大鼠重症失血性休克模型,在回输血前10 min分别给与白藜芦醇,SRT1720和虎杖苷,观察休克过程中的平均动脉压和血管反应性变化。在Ex527预处理组,放血前1h经股静脉给Ex527,之后同前给激动剂,观察休克过程中平均动脉压的变化。在回输血后120 min完成观察后拔管,局部消毒后缝合皮肤置于观察笼内记录24-48 h内不同处理组大鼠的生存时间。2.血管反应性的观察参考实验室已建立的脊斜肌微循环观察标本的制备方法,股动静脉插管后将大鼠置于微循环观察台上,持续滴加Kreb液维持脊斜肌的温度、湿度和pH稳定,采用不同浓度的去甲肾上腺素先后刺激小动脉,检测并记录引起血管收缩的最小浓度。同步观察各处理组不同时间点的平均动脉压和去甲肾上腺素阈值的变化。3.采用SIRT1/3去乙酰化酶活性检测试剂盒分别检测不同处理组SIRT1和SIRT3的活性变化,同前第一部分分离回输血后120 min大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞,并检测不同处理组血管平滑肌细胞线粒体超微结构的改变,线粒体通透性转变孔的开放,线粒体膜电位的去极化以及细胞内ATP含量的变化。以进一步查明SIRT1激动剂SRT1720,白藜芦醇和虎杖苷对重症休克血管平滑肌SIRT1和SIRT3活性,平滑肌细胞线粒体的结构和功能的影响。4.统计学分析:数据以均数±标准差(χ±s)表示。采用SPSS13.0软件进行分析,组间比较使用单因素方差分析(one way ANOVA)后,进行多重比较检验,方差齐时用LSD法;方差不齐时使用Welch法校正,采用Dunnett’sT3法进行两两比较。不同时间点各组之间平均动脉压和去甲肾上腺素阈值采用重复测量的方差分析和多元方差分析。采用Kaplan-Meier法分析生存时间,并用Log-Rank方法进行检验后采用多重比较法进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义,n代表实验动物数。研究结果:1.SIRT 1激动剂和虎杖苷可显著抑制重症休克血管平滑肌SIRT1和SIRT3活性的下降。在重症休克回输血前给于不同的药物治疗后,大鼠动脉血管的SIRT1和SIRT3的活性显著增加,Ex527预处理后则能显著降低三种保护剂对SIRT1/3的激活作用,不同处理组之间差异具有显著性(F值分别为25.142和16.669,P值均<0.001)。与休克组相比,白藜芦醇组SIRT1和SIRT3的活性分别增加了38.19± 2.84%和 47.70±5.78%。SRT1720 组 SIRT1 和 SIRT3 的活性分别增加了36.47±3.75%和33.63±4.80%。虎杖苷组SIRT1和SIRT3的活性分别增加了33.13±2.97%和45.83±7.30%(P值均<0.001)。2.SIRT1激动剂和虎杖苷治疗后,血管平滑肌细胞的线粒体损伤与休克组相比显著得到改善。各组线粒体结构的Flameng评分之间存在显著性差异(F=86.135,P<0.001)。回输血后120min,休克组线粒体的Flameng评分较假手术组显著增加,约增加了2.46倍(P<0.001)。虎杖苷治疗组,SIRT1激动剂SRT1720和白藜芦醇治疗组的Flameng评分较休克组分别降低了64.30±3.72%,57.78±2.89%和54.18±8.46%(P值均<0.001)。3.SIRT1激动剂和虎杖苷可显著增加重症休克时血管平滑肌细胞内ATP的含量。Ex527则能显著抑制激动剂对细胞内ATP的增加,不同处理组之间存在显著性差异(F=38.757,P<0.001)。与休克组相比,SRT1720治疗组血管平滑肌细胞内的ATP含量增加了73.60±32.30%,白藜芦醇组增加了64.91±22.74%,虎杖苷组增加了80.90±23.04%(P值均<0.001)。SIRT1特异性抑制剂Ex527预处理后,可抑制上述保护剂对平滑肌细胞内ATP含量的增加(P<0.001)。其中Ex527+白藜芦醇组较白藜芦醇组下降了32.76±12.02%(P=0.019),Ex527+SRT1720组较SRT1720组下降了33.38±16.01%(P=0.036),Ex527+虎杖苷组较虎杖苷组下降42.86±7.88%(P<0.001)。4.SIRT1激动剂和虎杖苷可显著抑制重症休克时血管平滑肌细胞线粒体通透性转变孔的开放。SIRT1的抑制剂Ex527预处理后,各激动剂组钙黄绿素的平均荧光强度显著降低,不同处理组之间存在显著性差异(F=25.318,P<0.001)。在SIRT1激动剂SRT1720治疗组和白藜芦醇治疗组,平滑肌细胞内钙黄绿素的平均荧光强度较休克时分别增加了54.00±20.44%和62.86±19.21%(P值均<0.001)。Ex527预处理后细胞内钙黄绿素的荧光强度较单纯激动剂治疗组分别下降了40.83±8.46%和30.79±22.41%(P值均<0.001)。虎杖苷治疗组线粒体钙黄绿素的平均荧光强度较休克组增加了68.40±20.79%,Ex527预处理后细胞内钙黄绿素的荧光强度较虎杖苷组下降了30.40±5.39%(P值均<0.001)。5.SIRT1激动剂和虎杖苷均能显著抑制重症休克时平滑肌细胞线粒体膜电位的下降,Ex527预处理后则能显著抑制线粒体膜电位的恢复,不同处理组之间存在显著性差异(F=28.759,P<0.001)。与休克组相比,线粒体膜电位去极化的细胞在SRT1720,白藜芦醇和虎杖苷组分别下降了62.13±5.73%、59.32±4.66%和68.45±5.73%(P值均<0.001);而Ex527预处理后,线粒体去极化的细胞较单独激动剂治疗组分别增加了78.66±19.27%(P<0.001)、50.55 ± 7.80%(P=0.002)和83.66 ±9.14%(P<0.001)。6.SIRT1激动剂和虎杖苷显著改善重症休克顽固性低血压和低血管反应性。SIRT1的抑制剂Ex527可抑制SIRT1激动剂对平均动脉压和血管反应性的恢复。不同处理组之间存在显著性差异(F值=154.320,P<0.001);不同时间之间也存在显著性差异(F值=713.811,P<0.001),而且不同处理和时间之间存在交互效应(F值= 19.500,P<0.001)。回输血后120 min,休克组肠系膜小动脉对去甲肾上腺素反应的阈值增加到失血前的22.7倍,平均动脉压降低到39.50±12.43mmHg,显著低于假手术组(P值分别为0.004和0.001)，在SIRT1激动剂SRT1720、白藜芦醇和虎杖苷治疗组,去甲肾上腺素阈值分别增加到失血前的5.68倍,8.72倍和3.60倍,但显著低于休克组(P值分别为0.008,0.025和0.006);平均动脉压分别增加到83.45±11.74mmHg(=0.002),71.40±6.30mmHg(P=0.012)和87.98±8.48mmHg(P=0.001),较休克组显著改善。Ex527预处理1 h后造模,可显著抑制各激动剂对重症休克大鼠平均动脉压的恢复。Ex527+SRT1720,Ex527+Res和Ex527+PD组的平均动脉压分别降低到45.72±18.16mmHg(P=0.043),37.90±5.47mmHg(P<0.001),53.13±9.05mmHg(P=0.001),显著低于各激动剂组。7.SIRT1激动剂和虎杖苷延长了重症休克大鼠的存活时间。不同处理组大鼠的生存时间之间存在显著性差异(LogRank:χ2=69.925,P<0.001)。休克组大鼠的中位生存时间是8h,24h死亡率是100%。在休克SIRT1激动剂SRT1720和白藜芦醇治疗组,大鼠的中位生存时间分别是14.0 h和13.5 h;在休克虎杖苷治疗组,大鼠的中位生存时间是26h,较休克组显著延长(P<0.001),并优于SRT1720组(P=0.003)和白藜芦醇组(P=0.047);而在SIRT1抑制剂Ex527+白藜芦醇组、Ex527+SRTI720组和Ex527+虎杖苷组,大鼠的中位生存时间分别减少为7.5 h,6.0 h和10.0 h,与激动剂组相比显著缩短(Log Rank检验后进行多重比较P<0.001),与休克组相比无显著性差异。结论1.重症休克过程中血管平滑肌SIRT1和SIRT3去乙酰化酶活性进行性下降,它将促进线粒体通透性转变孔开放,进而引起线粒体结构和功能渐进性损伤。2.体外培养的人小动脉平滑肌细胞缺氧复氧实验证明缺氧复氧时SIRT1,SIRT3和PGC1α的蛋白表达显著下调,SIRT3的去乙酰化酶活性降低,促使线粒体蛋白CypD过度乙酰化。用分子生物学方法(慢病毒载体介导SIRT1过表达和/或siRNA干扰抑制SIRT1或PGC1α的表达)证实过表达SIRT1经PGC1α调控缺氧复氧时SIRT3活性的下降和CypD的过度乙酰化,进一步证明了SIRT1/SIRT3和CypD乙酰化之间的相互关系,确定了SIRT1-PGC1α-SIRT3-CypD 通路。3.SIRT1激动剂SRT1720、白藜芦醇和虎杖苷显著抑制重症休克时SIRT1去乙酰化酶活性的下降,抑制血管平滑肌细胞线粒体通透性转变孔的开放和线粒体膜电位的去极化,保护线粒体的结构和功能,进而改善重症休克时的血管反应性,升高平均动脉血压,延长动物生存时间。提示重症休克时SIRT1对血管平滑肌细胞线粒体通透性转变孔的调控具有重要意义,为重症失血性休克的治疗提供了新的药物作用靶点。寻找SIRT1的激动剂为防治重症休克细胞损伤提出新思路。总之,本文通过在体和离体实验证明,重症休克时血管平滑肌SIRT1/3活性下降引起CypD乙酰化水平增加,CypD与线粒体内膜蛋白ANT的亲和力增强,促进线粒体通透性转变孔开放,进而导致线粒体和细胞损伤;激活SIRT1可抑制重症休克时血管平滑肌细胞线粒体通透性转变孔的开放,保护线粒体的功能,改善血管反应性。