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先天免疫在无脊椎动物抵抗病原感染和入侵过程发挥重要作用。聚羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)作为短链脂肪酸3-羟基丁酸的聚合物,是原核生物在碳过剩、氮缺乏等条件下在胞内积累的能量物质。PHB可在水产动物体内全部或部分降解为3-羟基丁酸,通过多种生物过程和方式促进消化吸收、提高动物免疫力并抵御病原感染。因此PHB作为水产饲料添加剂和免疫刺激剂具有广阔的应用前景。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是水产经济动物重要的致病菌,给鱼类和甲壳动物养殖业造成巨大的经济损失。与高等动物不同,甲壳动物缺少由抗体和补体所诱导的特异性免疫应答,因此解析甲壳动物的先天免疫机制对抵御病原入侵和提高自身抗病力显得尤为重要。本团队前期研究表明,PHB抑制了凡纳滨对虾仔虾(Litopenaeus vannamei)肠道中弧菌的增殖,提高了养殖存活率和抵抗弧菌感染的能力,但其细胞学基础和分子机理仍不清楚。本研究以红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii)为实验对象,以虾类主要致病菌V.parahaemolyticus为实验病原菌。利用FITC标记含有PHB的Halomonas菌体(HM-PHB)与红螯螯虾血细胞共孵育。荧光显微镜观察离体培养的血细胞表明,血细胞的半颗粒细胞(SGs)和颗粒细胞(Gs)能够吞噬HM-PHB。流式细胞检测表明,SGs和Gs对HM-PHB吞噬率分别达到9.39±0.29%和1.92±0.38%。透射电镜观察进一步证实,注射HM-PHB 2 h后血细胞完成吞噬作用,菌体完整;18 h后菌体裂解;36 h后己观察不到菌体膜,PHB颗粒形状不规则己被降解,说明HM-PHB可被颗粒细胞和半颗粒细胞吞噬和利用。为了进一步研究PHB单体3-羟基丁酸的作用,将0、0.001、0.01、0.1和1 mg/mL 3-羟基丁酸加入TSB培养基和L-15培养基中,分别培养V.parahaemolyticus和血细胞。扫描电镜观察表明,1 mg/mL 3-羟基丁酸可降低V.parahaemolyticus生长速率,造成V.parahaemolyticus菌体萎缩。流式细胞检测表明,1 mg/mL 3-羟基丁酸增加血细胞对V.parahaemolyticus吞噬率,其中半颗粒细胞对于V.parahaemolyticus的吞噬率显著增加(P<0.05),表明半颗粒细胞是PHB增强机体免疫力的主要效应细胞。克氏原螯虾血细胞相关免疫酶活性检测表明,1 mg/mL 3-羟基丁酸能提高溶菌酶(LZM)和酸性磷酸酶(ACP)活性。利用二代转录组测序,数据初步分析表明,注射3-羟基丁酸后螯虾血细胞内与细胞黏附和伪足运动作用相关的微管蛋白表达上调,推测其抑制了细胞的凝结,促进了血细胞在动物体内的流动,有利于继续捕获入侵的病原;另外3-羟基丁酸还调节了细胞的多个代谢过程,推测可能也与细胞免疫相关。后续将利用RT-PCR进一步研究相关免疫基因的表达变化,通过RNAi确定免疫调节的主效基因,并在细胞水平上进行功能基因验证。本研究不仅为探讨PHB和3-羟基丁酸对细胞的免疫机制奠定基础,而且为PHB作为免疫增强剂在水产养殖中的应用提供理论依据。