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研究目的：食管鳞癌是一种常见的预后较差的胃肠道恶性肿瘤,尽管目前手术、放疗及化疗等手段不断改进,食管鳞癌患者的5年生存率仍不足30%。食管鳞癌预后主要与肿瘤侵犯的深度、转移淋巴结数目、远处转移与否等有明显相关性。除了这些临床病理因素外,目前用于预测食管鳞癌发生发展及预后有关的分子标记物研究也取得了很大进展,食管癌分子标记物可以进行食管癌早期检测或者区分食管鳞癌高风险及低风险病人以得到最佳治疗。PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)又名TEP1或者MMAC1,位于染色体10q23.3, PTEN蛋白的脂类磷酸酶活性主要作用机制是可将3,4,5-三磷酸盐(PIP3)去磷酸化形成4,5-二磷酸盐(PIP2),进而抑制PIP3与PDK1/Akt的丝苏氨酸位点结合,此作用导致了Akt及其下游通路的激活受抑制。PTEN蛋白通过此拮抗PI3K/Akt信号通路而起到了肿瘤抑制作用,因此其被认为是重要的抑癌基因。目前很多研究表明PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)与前列腺癌、乳腺癌及脑恶性胶质瘤等有明显相关性,但是PTEN在食管鳞癌中的表达情况及其与食管鳞癌患者预后的关系研究仍存在矛盾的结论,仍需进一步的研究证实其相关性。除此之外,PTEN失表达与食管鳞癌患者术后淋巴结转移复发关系目前仍无任何报道。PTEN基因启动子上具有富含CpG岛的区域,为DNA甲基化提供了一种可能。目前多项研究表明PTEN启动子的甲基化与多种肿瘤组织中的PTEN蛋白低表达有明显相关性,例如低分化的脑胶质瘤、黑色素瘤及肺癌等中均发现PTEN启动子甲基化是参与PTEN表达降低的一种机制。但是目前关于PTEN甲基化在食管鳞癌中的报道较少,仅有Pan研究了哈萨克斯坦族的食管鳞癌病人的甲基化情况,其发现PTEN甲基化水平在食管鳞癌病人(中位甲基化率10%)中明显高于正常人(中位甲基化率6.0%),男性食管鳞癌病人的PTEN甲基化水平明显高于女性,同时PTEN甲基化水平与食管鳞癌的淋巴结转移及肿瘤分化程度有关(p<0.05),但是目前仍无食管鳞癌中PTEN甲基化与PTEN表达水平相关性的研究。针对以上仍未解决的问题,本论文旨在探讨并明确食管鳞癌中PTEN的表达情况及其与食管鳞癌患者预后、淋巴结转移复发及PTEN启动子甲基化之间的相关性。研究方法：本研究主要纳入了2006年1月-2007年12月期间在山东大学附属省立医院胸外科行胸中段食管鳞癌切除的74例患者。利用免疫组化及实时定量PCR (qRT-PCR)测定了食管鳞癌及癌旁正常食管上皮PTEN的表达情况(蛋白及mRNA水平),研究了食管鳞癌中PTEN蛋白表达情况与各临床病理因素的相关性,评估了PTEN蛋白阴性表达与食管鳞癌患者生存率及淋巴结转移复发之间的关系。为了验证我们的临床结论,我们以慢病毒为载体稳定转染食管鳞癌细胞系(Eca109),以稳定抑制PTEN的表达水平。然后分析不同处理组的细胞增殖实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验等体外实验的变化情况；同时我们将不同处理组的食管鳞癌细胞系注射入裸鼠皮下组织中形成移植瘤生长模型,分析观察了不同组中裸鼠移植瘤的生长速度变化情况。我们还利用Western Blot研究了可能参与PTEN作用的下游指标(FAK及p-FAK)的表达变化情况。在甲基化研究方面,我们利用甲基化特异性PCR(MSP)分析了74例食管鳞癌样本及四种食管鳞癌细胞系中的PTEN甲基化情况,检测了PTEN甲基化在食管鳞癌患者预后及各临床病理因素中的关系。在临床样本水平,我们对PTEN的甲基化状态及其与PTEN表达情况的关系进行了详细分析；同时在食管鳞癌细胞系水平,我们还利用5-氮杂胞苷处理PTEN甲基化阳性的食管鳞癌细胞系(Eca9706),分析了经5-氮杂胞苷处理后PTEN表达情况的变化及甲基化状态的变化情况。结果：食管鳞癌组织中的PTEN mRNA水平明显低于癌旁正常食管上皮组织(p<0.001),41例(55.4%)的食管鳞癌组织呈PTEN mRNA低表达(相比于癌旁正常食管上皮),38例(51.4%)的食管鳞癌组织呈PTEN蛋白阴性表达；临床病理因素分析中,PTEN蛋白阴性表达与肿瘤的侵犯深度(T分期)及淋巴结侵犯情况(N分期)有明显相关性(p=0.005及p=0.021)；单因素分析表明PTEN蛋白阴性表达与患者5年生存率及3年淋巴结转移复发率明显相关(p=0.001及p=0.019),但多因素回归分析表明PTEN蛋白阴性表达并不是食管鳞癌患者5年生存率及3年淋巴结转移复发率的独立预后因素(p>0.05)；慢病毒稳定抑制PTEN表达的食管鳞癌细胞系相比于阴性对照组细胞系的细胞增殖速度、细胞迁徙、细胞侵袭能力明显增强(p<0.05),裸鼠体内移植瘤生长实验表明稳定抑制PTEN表达后移植瘤的生长速度明显增强(p<0.05)。机制研究方面,Western Blot提示不同处理组中FAK及p-FAK均无明显表达变化,表明FAK及p-FAK不是参与PTEN机制的主要指标,可能其他通路或者因子参与PTEN在食管鳞癌中的作用机制,仍需进一步研究明确。甲基化研究方面,仅有14例(18.9%)的食管鳞癌组织及1例食管鳞癌细胞系(EC9706)存在PTEN启动子的甲基化；PTEN甲基化与各临床病理因素及临床预后无明显相关性；详细分析PTEN甲基化状态及PTEN mRNA/蛋白的关系发现PTEN甲基化是PTEN失表达(mRNA及蛋白水平)的一种可能机制,经5-氮杂胞苷处理后,PTEN的甲基化状态被逆转,且PTEN的mRNA及蛋白表达水平明显升高,此在细胞水平上证实了PTEN甲基化与PTEN表达水平的关系。结论及意义：食管鳞癌组织中存在PTEN的低表达情况且比较普遍；尽管PTEN蛋白阴性表达不是患者生存率及淋巴结复发率的独立危险因素,但是PTEN蛋白阴性表达与食管鳞癌患者生存率及淋巴结转移复发率有明显相关性,未来PTEN蛋白阴性表达可能作为预测食管鳞癌预后的一种有效的分子标记物；临床分析及细胞试验均表明食管鳞癌中PTEN甲基化是PTEN低表达的一种可能机制,但是因为PTEN启动子甲基化率在食管鳞癌中比较低,其可能不是食管鳞癌中导致PTEN低表达的主要机制,可能其他的一些机制,如转录后调节或者翻译水平调节等是导致PTEN低表达的主要机制,其仍需进一步的研究进行证实。