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目的:构建人源胃癌天然库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体库,以血管内皮生长因子受体-3作为抗原,运用核糖体展示技术对该库进行筛选,以期得到特异性高的人源血管内皮生长因子受体-3抗体,为开发治疗性人源抗体奠定很好的实验基础。方法:收集20人新鲜外周血（胃癌患者10名、健康成人志愿者6名、每例各5ml;2岁儿童2名、新生儿2名各2ml）,进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,通过设计合适的优化引物用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区基因（variable region of heavychain,VH）、轻链可变区基因（variable region of light chain,VL）和作为间隔区的轻链恒定区基因（consist region of light chain,CK）。采用改进的重叠延伸PCR（SOE PCR）技术将VH和VL进行拼接,连接肽为（Gly4Ser）3。之后引入构建核糖体展示单链抗体（scFv）库模板所需元件,包括一个T7启动子、一个核糖体结合位点（Kozak序列）和翻译起始密码,以及作为间隔区的CK基因。模板基因片段连接T-Vector转化E.coli DH5a大肠杆菌,对所构建的单链抗体库进行菌落PCR鉴定和测序分析。我们选取人血管内皮生长因子受体-3作为目标抗原对该单链抗体库进行核糖体展示筛选,四轮筛选后,选取特异性最好的一轮筛选产物为实验获得的最佳anti-VEGFR-3单链抗体基因。随后经NcoI和XhoI双酶切将anti-VEGFR-3单链抗体基因连入表达载体PET-28a（+）并转化E.coli BL21进行表达,在LB培养基中37℃、150r/min培养过夜。然后加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达2～5h,收获菌体,15%SDS-PAGE电泳观察表达结果,纯化抗体并复性,之后对其进行抗原特异性结合活性检测。结果:1、所构建的人源胃癌单链抗体库的库容量为3.1×1013,经菌落PCR鉴定和测序分析阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。2、第三轮筛选得到的单链抗体基因片段为本实验获得的最佳基因片段,这样我们成功获得了抗人血管内皮生长因子受体-3的单链抗体基因序列。3、表达菌经IPTG诱导表达5小时后,15%SDS-PAGE电泳结果可见约24KD的融合蛋白条带。4、对筛选到的抗人血管内皮生长因子受体-3单链抗体序列进行软件分析,发现该抗体的重链可变区属于VH2亚群,轻链可变区属于VK4亚群。5、经初步的抗原特异性结合活性检测,人源VEGFR-3抗体可以特异识别VEGFR-3抗原。结论:成功构建了库容量高、多样性好的人源性胃癌核糖体展示单链抗体库,经过核糖体展示技术对库进行筛选,得到了特异性的抗人血管内皮生长因子受体-3的单链抗体基因序列,已将该基因序列分型并在大肠杆菌中诱导表达成功,为后续抗体蛋白定量、纯化抗体效价测定以及抗体分子结构的研究打下扎实的实验基础。