心血管疾病是当今世界上威胁人类最严重的疾病之一,其发病率和死亡率已超过肿瘤性疾病而跃居第一。他汀类化合物（HMG-CoA还原酶抑制剂）是HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂,通过竞争性结合胆固醇合成的限速酶——HMG-CoA还原酶,阻断甲羟戊酸的形成,从而降低胆固醇的合成。与其他降脂药物相比,他汀类药物以其在降低血清胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇方面效果显著、副作用少、安全性高,成为目前临床上治疗高胆固醇血症的一线药物。2008年国际市场上他汀类药物总销售额合计约390亿美元,高居各类药物销售额榜首,占全球医药市场总销售额的5.5%。作为最早被发现的他汀类化合物和转化普伐他汀的直接底物,美伐他汀在他汀药物发展史上占有重要地位美伐他汀生物合成基因簇及假想的生物合成途径的研究表明美伐他汀是一类典型的聚酮类化合物,为从分子手段提高产量提供了新的思路和依据。美伐他汀的生物合成由起始单元乙酰辅酶A开始,丙二酰辅酶A为延伸单元,在美伐他汀生物合成基因簇各个基因的协同作用下完成。基因簇全长38kb,包含9个基因,分别命名为mlcA-mlcH以及调节基因mlcR。其中,mlcF基冈长约800 bp,编码假想的氧化还原酶,分子量大小约为27.9 kDa,和洛伐他汀生物合成基因簇中orf5序列相似性较高,但功能未知,推测与ML-236B生物合成途径相关。本文利用RT-PCR技术成功地克隆了美伐他汀产生菌橘青霉（Penicillium citrinum）中美伐他汀生物合成基因簇中的mlcF基因,通过测序及序列比对证实,克隆序列与报导的mlcF序列完全一致,全长756 bp,GC含量为50.93%,编码251个氨基酸,其蛋白理论分子量为27,952 Da,等电点为8.43。氨基酸序列与洛伐他汀产生菌土曲霉（Aspergillus terreus）的洛伐他汀生物合成基因簇中的orf5有较高同源性,达57%。将片段构建到原核表达载体pET28a（+）,以E.coliBL21（DE3）为宿主添加IPTG诱导表达。重组蛋白以包涵体形式存在,使用8 M尿素将其变性,采用Ni²⁺亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,然后利用尿素浓度梯度使其复性,用圆光二色谱仪分析重组蛋白二级结构。同时,对MlcF进行生物信息学分析。将MlcF的全长氨基酸序列提交ExPAsy服务器,对蛋白质Motif识别。在其蛋白序列中含有1个糖基化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,2个豆蔻酰化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪氨酸激酶磷酸化位点。通过神经网络算法及隐马可夫模型算法分析推测橘青霉MlcF不存在信号肽,不是分泌蛋白。经TMpred预测没有发现跨膜结构域。在线蛋白预测软件PSIPRED服务器预测的橘青霉MlcF二级结构表明MlcF由6个α-螺旋,7个β-折叠及多个无规则卷曲组成。但用圆二光色谱仪对重组蛋白进行了二级结构测定,MlcF扫描结果表明无规则卷曲的程度较高。同时,图中没有显示出标准的α-螺旋、β-折叠特征吸收。向Swiss-Model Repository提交橘青霉MlcF的氨基酸序列,服务器自动搜索与之匹配的最佳模板为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的FSH1/YHR049W蛋白（PDB序列号为1ycd）,预知相似性有16%。随着人们对他汀类药物需求的不断扩大,分子生物学技术的不断成熟,运用分子生物学手法对他汀类药物产生菌进行菌种改良成已为一种趋势,越来越多的功能基因被发现和克隆。人们迫切希望知道这些基因编码的蛋白的晶体结构以便更好地进行功能研究。但是由于技术手段的限制,很难获得某些蛋白晶体。因此,利用已知蛋白的结构来预测位置蛋白的三维结构成为解决这一问题的重要方法。最终目标是通过蛋白质相互作用网络加上基因动态表达研究、蛋白质表达量分析、蛋白定位以及基因功能分析等,最终了解细胞内各种生理反应的发生及其调节机制,揭示MlcF在ML-236B生物合成途径中的作用。