论文部分内容阅读
根据GenBank中已发表的PCV2基因序列，设计2对特异性引物，一对用于扩增出PCV2的全基因组序列；另一对引物用于扩增Cap基因。首先，一对引物扩增PCV2的全基因组序列，PCR结果表明PCV2基因组全长为1767bp，命名为sh0901(GenBank登录号GU124593.1)。将PCV2的PCR产物通过酶切连接构建到pET-30a载体上，得到重组质粒pET30a-PCV2，修改PCV2的稀有密码子的偏爱性，将偏爱密码子改为非偏爱密码子。将PCV2基因组685bp-843bp之间编码氨基酸的密码子改为非偏爱密码子序列，命名为pET30a-PCV2-C。pET30a-PCV2与pET30a-PCV2-C经EcoRⅠ酶切纯化回收，T4连接酶自体环化后，用LipofectamineTM2000分别转染PK-15细胞，培养72-96小时后收取病毒液并且盲传6代，用PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测结果表明环化的PCV2基因组在细胞内能感染复制，初步在细胞水平上比较PCV2-C与PCV2毒株的增值快慢差别。我们通过遗传改造成功获得弱毒株PCV2-C，且获得的弱毒株PCV2-C具有感染性。另一对引物用于扩增Cap基因，获得一约578bp的特异性片段，将PCR的扩增产物连到pMD18-T载体上，经序列测定，其序列与目的基因序列一致，经酶切后连入pET-30a载体，构建重组质粒，筛选的阳性重组质粒pET30a-Cap和空表达载体pET30a酶切鉴定，测序正确。重组质粒pET30a-Cap转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后表达的重组蛋白分子量为28.0kD，经超生破碎后SDS-PAGE电泳分析表明其表达的蛋白为可溶性的。Western-Blot分析表明，该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应，表明该重组蛋白具有良好的反应原性，为进一步研究猪圆环病毒亚单位疫苗奠定了基础。