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肾结石（renal calculi,RC）是晶体物质（常见成分为一水草酸钙）在肾脏的异常聚积所致,是临床上较为多见的一类泌尿系统疾病。流行病学调查显示,我国肾结石患病率呈逐年升高趋势,且好发于成年男性。结晶肾损伤是肾结石的早期疾病状态,若不及时进行干预,患者的肾功能会逐渐受到损害。中药是中华民族的瑰宝,具有深厚的历史文化底蕴,值得深入挖掘。目前,中药治疗以其独特的多成分、多靶标、整体性优势越来越受到临床医生的重视,常常用来作为疾病的辅助治疗手段。复方金钱草颗粒是临床上常用的一种治疗泌尿系统结石及尿路感染的中药成方制剂,具有清热利湿、通淋排石、消炎止痛的功效。细胞膜色谱（cell membrane chromatography,CMC）是一种将提取后的细胞膜碎片与硅胶键合,形成细胞膜固定相（cell membrane stationary phase,CMSP）,并采用色谱分析方法研究药物成分与细胞膜受体相互作用的生物亲和色谱技术,其操作简单、稳定、高效,兼具色谱分离和受体亲和双重特性。本课题的研究内容主要从以下三个方面进行阐述。1、复方金钱草颗粒提取工艺优化及其化学成分鉴定研究复方金钱草颗粒因其在治疗泌尿系统结石方面具有良好的疗效,引起相关研究者的广泛兴趣。然而,目前复方金钱草颗粒尚无通用的提取工艺,每个实验室的提取方法不一致,导致其结果稳定性较差,且复方金钱草颗粒的成分复杂多样,尚未见报道。正交试验和响应曲面法具有科学性高,操作时间短,实验步骤简单的特点,且响应曲面法可以通过回归模型预测最佳提取参数,因此,这两种方法被广泛应用于中药材提取工艺的研究。为了优化复方金钱草颗粒提取工艺并明确其化学成分,在本章中,建立了复方金钱草颗粒成分含量的测定方法,并以其中的芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ这3个成分为代表进行方法学验证,考察其线性、精密度、重复性、加样回收率及稳定性,然后结合正交试验和响应曲面法这两种统计学方法,以14个复方金钱草颗粒指标性有效成分的峰面积之和为评价指标,优化得到有效成分含量最大化提取工艺。结果显示,以芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ为代表进行的方法学验证,其线性优良,精密度高,重复性好,准确度高,稳定性好。因此,该方法适用于复方金钱草颗粒成分含量的测定。结合正交试验和响应曲面法,得到复方金钱草颗粒的最佳提取条件为超声提取时间10 min,提取温度55℃,乙醇比例55%,并根据上述条件进行验证,证明其结果稳定可靠。此外,采用了UHPLC-QTOF/MS联用技术对复方金钱草颗粒提取液中的化学成分进行了快速的分离分析,共鉴别出69个化合物,其中以萜类、酚酸类和黄酮类成分居多。2、全二维HK-2和HK-2/CIKI细胞膜色谱比较分析系统的构建及其应用复方金钱草颗粒常被用于治疗肾结石患者,但是其发挥抗肾结石作用的药效物质及机理仍不明确,限制了它的推广应用。细胞膜色谱是一种生物亲和色谱技术,常用于从中药等复杂体系中筛选出潜在活性组分。然而,由于中药组分会与细胞膜上的非功能性受体结合,导致筛选到的活性成分往往没有好的药效,其膜受体靶标专属性不高,在随后的药效验证上浪费了大量的时间,因此,需要构建特定疾病的细胞模型来真实的模拟药物与受体间的相互作用。为了从复方金钱草颗粒中筛选出具有抗结晶肾损伤药效的潜在活性组分,在本章中,以浓度为1000μM的Na2C2O4溶液刺激HK-2细胞24 h,成功构建了结晶肾损伤（CIKI）细胞模型,并通过免疫印迹实验证实了一水草酸钙的刺激会下调HK-2细胞膜上整合素β1的表达,同时在此基础上,构建了全二维HK-2和HK-2/CIKI细胞膜色谱比较分析系统,接着通过阳性药GLPG0187和阴性药地塞米松对该比较分析系统的选择性进行考察,然后使用该比较分析系统对复方金钱草颗粒提取液中的化学成分进行筛选,初步鉴定得到25个化合物,其中9个化合物在HK-2细胞膜色谱模型上有保留,12个化合物在HK-2/CIKI细胞膜色谱模型上有保留,最后使用对照品对其中的7个潜在活性组分（大豆皂苷Ⅰ、黄芩素、芹菜素、槲皮素、木犀草素、6-羟基木犀草苷、芒果苷）进行了验证。3、复方金钱草颗粒中抗结晶肾损伤潜在活性组分的药效验证由于细胞表面的膜受体种类复杂多样,导致使用细胞膜色谱技术筛选到的活性组分存在一定的假阳性可能,因此,需要对化合物开展进一步的药效研究。为了验证第三章中通过全二维HK-2和HK-2/CIKI细胞膜色谱比较分析系统筛选到的潜在活性组分抗结晶肾损伤药效,在本章中,选择了其中的大豆皂苷Ⅰ、黄芩素、芹菜素、木犀草素、6-羟基木犀草苷、芒果苷这6个在HK-2/CIKI细胞膜色谱模型上有显著保留的化合物。首先考察了它们对HK-2/CIKI细胞的保护作用,实验结果显示,黄芩素、芹菜素、木犀草素和芒果苷对HK-2/CIKI细胞具有一定的保护作用,大豆皂苷Ⅰ和6-羟基木犀草苷对HK-2/CIKI细胞具有显著的保护作用。此外,还使用流式细胞术考察了6-羟基木犀草苷对HK-2/CIKI细胞凋亡的影响,实验结果显示,6-羟基木犀草苷能够抑制HK-2/CIKI细胞的凋亡,且给药浓度越高,其抑制细胞凋亡的能力也就越强。6-羟基木犀草苷在复方金钱草颗粒中含量很低,但是相比于其它组分,6-羟基木犀草苷具有更好的抗结晶肾损伤药效,值得进一步研究。同时,还考察了芒果苷对小鼠结晶肾损伤的影响,实验结果显示,芒果苷能够降低小鼠肾脏内草酸钙结晶的沉积,减轻草酸钙结晶诱导产生的肾组织病理损伤,抑制草酸钙结晶所致的OPN、MCP1和CD44表达的上调。本课题通过正交试验和响应曲面法优化了复方金钱草颗粒提取工艺,并使用UHPLC-QTOF/MS联用技术明确了复方金钱草颗粒的化学成分;通过构建的全二维HK-2和HK-2/CIKI细胞膜色谱比较分析系统从复方金钱草颗粒中筛选到了抗结晶肾损伤活性组分;开展相关实验对部分活性组分进行了初步的药效验证。通过本课题的研究,进一步挖掘了复方金钱草颗粒的内在价值,为后续的新药开发奠定了坚实的基础。