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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）,是与年龄高度相关的原发性神经退行性疾病,以神经原纤维缠结（ neurofibrillary tangle, NFT）形成和老年斑（senile plaque, SP）为主要病理特征。AD的病因和发病机制迄今尚不清楚,临床上也缺乏根本有效的治疗手段,因此有关AD发病机制的探索以及新的药物作用靶点或有效的干预环节的寻找,是当今AD研究的热点。PTEN（Phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10）属蛋白酪氨酸磷酸酶,具有脂质和蛋白质双重特异性磷酸酶活性,是细胞信号转导的重要调节分子,它与细胞的生长、分化、凋亡调控等方面都有密切的关系。随着近年来人们对PTEN认识的不断增加,PTEN在中枢神经系统,尤其是中枢神经系统损伤性疾病发生发展中的作用也日益受到重视。但是,PTEN与AD发生发展的关联及其意义有待于探索。本实验室先期工作初步探索了PTEN在拟AD样细胞模型发生发展中的变化状况。首次观察到,在冈田酸（Okadaic acid, OA）诱导的拟AD样细胞模型的发生发展中,PTEN蛋白水平呈现动态变化,即随着细胞损伤程度的加重和磷酸化tau蛋白水平的改变,PTEN蛋白水平表现出先升高后下降的现象,提示PTEN可能在AD的发病机制中起着一定的作用。在此基础上,本课题首先在4个不同诱导因素诱导建立的拟AD样细胞模型中,通过观察PTEN蛋白水平、PTEN mRNA的动态变化以进一步明确PTEN在AD发生发展过程中的变化规律;进而采用慢病毒介导的RNA干扰技术阻断PTEN基因表达,分析其对冈田酸诱导的SH-SY5Y细胞拟AD样细胞模型发生中细胞损伤和tau（Ser396）蛋白过度磷酸化的影响,探索下调PTEN基因表达在AD样细胞模型发生中的作用;进而探索其作用的可能分子机制,以期深化理解AD的发病机制,为AD防治的新途径和抗AD新的药物靶点的研发提供理论和实验依据。本实验主要研究内容包括以下2个部分:1 PTEN在拟阿尔茨海默病样细胞模型发生发展中的变化分别以OA和β淀粉样蛋白多肽25-35(β- amyloid peptide 25-35, Aβ25-35)诱导SH-SY5Y细胞或SD大鼠胎鼠的皮层神经元原代细胞,建立拟AD样细胞模型,以细胞形态、磷酸化tau蛋白水平的变化作为反映细胞AD样指标,探讨AD样细胞模型诱导发生发展过程中PTEN蛋白水平、PTEN mRNA水平的变化规律,并分析其与细胞AD样发生发展的关联。结果表明,在4个AD样实验性细胞模型中均观察到OA或Aβ25-35所致的细胞皱缩、突起中断等细胞进行性损伤的形态学变化,磷酸化tau蛋白[p-tau(Ser396)]水平均呈现先缓慢升高后下降的变化,提示拟AD样细胞模型建立成功;1)在40 nmol/L OA诱导SH-SY5Y细胞的拟AD样细胞模型中,给予OA后3 h PTEN蛋白水平开始升高,6 h达到高峰,随后逐渐下降,48 h时PTEN蛋白水平低于0 h,但无显著性差异;PTEN mRNA表达水平也表现为升高,6 h即明显升高,24 h达高峰,随后略有下降,但至48 h仍明显高于0 h （P<0.01）。2)40μmol/L Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞时,PTEN蛋白水平3 h开始升高,12 h达高峰后逐渐下降,48 h时接近0 h值;PTEN mRNA表达水平6 h时下降,随后升高,12 h达高峰后略有下降,但48 h时仍高于0 h值（P<0.01）。3)20 nmol/L OA诱导大鼠胎鼠原代神经元细胞,PTEN蛋白水平3 h开始升高,12 h达到高峰,随后逐渐下降,48 h时PTEN蛋白水平明显低于0 h（P<0.01）。4) 20μmol/L Aβ25-35诱导大鼠胎鼠原代神经元细胞,Aβ25-35诱导后PTEN蛋白水平升高,6 h达到高峰随后下降,24 h的PTEN水平低于0 h（P<0.01）。上述结果提示,在4个AD样细胞模型发生发展中,PTEN表达均呈现先增强后减弱的动态变化,且PTEN蛋白水平的升高先于磷酸化tau（Ser396）蛋白水平的升高,提示PTEN与AD的发生发展可能具有一定的关联性,AD发生早期PTEN表达可能增强。2下调PTEN基因表达对OA所致SH-SY5Y细胞tau蛋白异常磷酸化的影响及可能的分子机制针对人PTEN基因的RNA干扰慢病毒颗粒和携带GFP的阴性慢病毒颗粒感染SH-SY5Y细胞,通过western-blot法和实时定量PCR技术鉴定PTEN基因的干扰效率约达到86.7%。采用40 nmol/L OA诱导细胞24 h建立拟AD样细胞模型,与未感染组细胞和感染阴性病毒载体的细胞相比,下调PTEN基因表达的细胞对于OA所致的细胞损伤具有一定的保护作用,表现为细胞形态改善,细胞活力增强,细胞内Ser396位点磷酸化tau蛋白的水平显著降低（P<0.05）。接着通过观察PI3K/Akt信号通路及其下游GSK-3β蛋白水平的变化对PTEN和Ser396位点磷酸化tau蛋白之间的关联进行探讨,发现下调了PTEN基因表达的SH-SY5Y细胞在OA孵育24 h后,与阴性对照组相比其Akt的活化形式p-Akt(Ser473)蛋白表达水平增加,PI3K/Akt信号通路激活,进而使p-GSK-3β（Ser9）蛋白水平升高而抑制GSK-3β的活性,使磷酸化tau(Ser396)蛋白水平降低。综上所述,本研究表明:1在AD样细胞模型发生发展过程中,PTEN表达呈现先增强后减弱的动态变化,且PTEN蛋白水平的升高先于磷酸化tau(Ser396)蛋白水平的升高,提示PTEN与AD发生发展可能具有一定的关联性,AD发生早期PTEN表达可能增强。2慢病毒介导的RNA干扰抑制PTEN基因表达可对抗OA诱导的tau(Ser396)蛋白异常磷酸化等AD样变化,提示PTEN表达增强可能具有促进AD发生的作用。3 PTEN对OA诱导的ta(uSer396)蛋白异常磷酸化的作用可能通过PI3K/Akt信号通路途径及其下游的GSK-3β进行调控。