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白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是引起对虾白斑综合征(White spot syndrome, WSS)的病原,其宿主十分广泛,包括人工养殖对虾及大部分野生虾蟹类等40余种,对虾在感染该病毒后2-7天死亡率可达100%,因此对全球虾养殖业危害较大。目前,NCBI上公布的WSSV全基因序列组只有三个,分别是泰国株(AF369029),中国大陆株(AF332093)和中国台湾株(AF440570),其同源性高达99.32%,但也存在一些主要的基因变异,其中之一为重复单元数量变化(variable number of tandem repeats, VNTR).为了研究ORF94中重复单元数量变化的差异,本研究对分离自江苏和浙江省的野毒株进行了ORF94基因扩增、序列比对和重复单元数量变化的分析,并选取重复单元数量区别较大的两株分离株人工接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii)记录死亡率,并探索VNTR与毒力的相关性。此外,病毒的囊膜对病毒的活动起到重要的作用,但目前关于该病毒囊膜蛋白间互作的研究鲜有报道,主要原因可能是缺乏有效细胞系。VP28是WSSV四个主要囊膜蛋白之一,其主要在病毒吸附和侵入过程中起作用。为了研究VP31和VP36A是否能与VP28之间发生相互作用,本研究对VP28、VP31和VP36A进行了克隆表达,纯化病毒并分离WSSV囊膜蛋白,利用Far-Western和Pull-Down assay的方法检测VP28与VP31和VP36A的互作。根据GenBank上白斑综合征病毒(WSSV)泰国株ORF94的基因组序列设计一对引物,将从江苏和浙江采集已发病白斑综合症地区的对虾提取病毒DNA,对目的片段基因进行扩增,并插入pMD-18T载体中构建克隆载体pMD-N,测序后与GenBank中收录的其他WSSV毒株进行同源性比对,发现这些序列与GenBank中收录的WSSV毒株同源性高于95%,同时,重复单元ORF94的序列差异分析显示重复单元数量介于2至14之间,第48位碱基差异较大。选取重复单元数量区别较大的两株分离株,分别分离自江苏赣榆和大丰,人工接种克氏原螯虾记录死亡率计算半数致死量,赣榆株为10-5.6,大丰株为10-5.5。然后根据其半数致死量采取肌肉注射的方法对克氏原螯虾进行攻毒。每隔12小时观察并记录一次克氏原鳌虾的存亡情况,将死亡及未死亡的部分虾于-40。C冻存,按上述方法进行重复单元ORF94的序列差异分析,发现攻毒后再分离的毒株间重复单元数量无差异,而第48位碱基差异较小,所以ORF94的序列差异可能与病毒毒株强弱的相关性不大。剩余的死虾浸泡在Davidson’s AFA固定液中,再用戊二醛固定,按常规方法做超薄切片,观察细胞及病毒形态。根据参考文献中的方法,利用Nonidet P-40、Triton X-114和丙酮等处理纯化过的菌体,分离出WSSV的蛋白。再以白斑综合征病毒(WSSV)赣榆株为模板,设计三对引物,分别扩增得到了VP28.VP31和VP36A的片段,将其分别T-A克隆到pMD-18T载体后,再分别亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-4T-3中,然后将重组质粒转入宿主菌BL21中,在37℃下用1mM浓度的IPTG诱导三个片段均获得良好的表达。经SDS-PAGE鉴定,其表达的融合蛋白约为28kDa、7kDa和62kDa,与预期值一致。利用Far-Western实验和Pull-Down assay实验检测VP28是否能与VP31或VP36A发生相互作用,结果是未发现它们之间有相互作用。