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[目的]
1.建立HPLC内标法测定腹腔注射给药后SD大鼠血清中高良姜素的高效液相色谱分析方法,并应用于大鼠体内高良姜素的血清药代动力学研究,以期获得相关的药代动力学参数。
2.采用高效液相内标法测定不同时间段SD大鼠尿液及粪便中高良姜素的含量,考察大鼠腹腔注射高良姜提取物后高良姜素的排泄途径及排泄情况。
3.运用HPLC-MS联用技术测定不同时间段SD大鼠的尿液,揭示大鼠腹腔注射高良姜黄酮类提取物后高良姜提取物黄酮类成分的代谢途径。
[方法]
1.高良姜提取物中高良姜素血药浓度-时间曲线研究
1.1血清中高良姜素分析方法的建立。
1.1.1色谱条件的选择采用本课题前期试验已优选出的色谱条件。
1.1.2样品预处理方法的筛选
(1)萃取溶剂的选择采用HPLC法比较不同萃取溶剂(乙酸乙酯、氯仿)的提取效果,以筛选出最佳萃取溶剂。
(2)涡旋混合时间的选择采用HPLC法比较不同涡旋混合时间(1min、2min、3min、4min、5min、6min)的提取效果,以筛选出最佳涡旋混合时间。
(3)涡旋混合次数的选择采用HPLC法比较不同涡旋混合次数(1次、2次、3次、4次、5次)的提取效果,以筛选出最佳涡旋混合次数。
1.1.3内标的选择与评价采用HPLC法对芦荟大黄素、1,8-二羟基蒽醌、大黄素、大黄酸、大叶茜草素结合内标的选择原则进行选择,以误差传递法评价内标法是否改善分析方法的精密度来确定最佳内标物。
1.1.4血清中高良姜素测定方法学考察取含高良姜素对照品血清样品,按照优选的样品预处理方法对样品进行处理,采用本课题前期的色谱条件,分别对其线性关系、回收率、精密度、稳定性等方法学进行考察。
1.2高良姜素血清药物浓度.时间曲线的测定SD大鼠腹腔注射不同剂量的高良姜提取物(剂量分别为0.7、1.4、2.0g生药/kg,折算成高良姜素分别为1.47、2.94、4.20mg/kg),采用优选出的样品预处理方法对血清样品进行预处理,并运用建立的高效液相内标法对各时间血清进行测定,以DAS2.1.1版药动学软件分析药物浓度-时间(C-T)曲线及药动学参数。
2.高良姜提取物后高良姜素的排泄研究
2.1排泄物中高良姜素分析方法学考察取高良姜素对照品排泄物样品,按照血清样品项下优选的样品预处理方法对样品进行处理,采用本课题前期的色谱条件,分别对排泄物样品的线性关系、精密度、回收率等进行方法学考察。2.2排泄实验SD大鼠腹腔注射高良姜提取物(剂量为1.4g生药/kg,折算成高良姜素为2.94mg/kg),采用优选出的样品预处理方法对排泄物样品进行预处理,并运用建立的高效液相内标法对各时间段排泄物进行测定,分析高良姜素的排泄情况。
3.高良姜素提取物中黄酮类化合物体内代谢产物研究SD大鼠腹腔注射高良姜提取物后(剂量为1.4g生药/kg,折算成高良姜素为2.94mg/kg),采集大鼠各时间段尿液。尿液样品经预处理后采用上述色谱条件,运用LC-MS联用技术测定大鼠各时间段尿液,分析高良姜提取物中黄酮类化合物的体内代谢情况。
[结果]
1.高良姜提取物中高良姜素的血药浓度-时间曲线研究
1.1血清中高良姜素分析方法的建立。
1.1.1色谱条件色谱柱:Shim-Pack C18柱(2.1mm×250mm,5.0μm);流动相A相为0.1％乙酸-水,B相为乙腈-甲醇-四氢呋喃(15:40:45);梯度洗脱程序为:0～20min,39%～61%B；20～30min,61%～100%B;30～40min,100%～100%B;流速0.2mL/min,紫外检测波长345nm,柱温:35℃,进样5μL。
1.1.2样品预处理方法的筛选
(1)萃取溶剂的选择乙酸乙酯提取液在相同萃取条件下,高良姜素及内标的色谱峰响应强度最大,因此选择乙酸乙酯作为本研究的萃取溶剂。
(2)涡旋混合时间的选择在其他条件相同的情况下,样品在涡旋混合3min时,高良姜素及内标的色谱峰响应强度最大,因此选择涡旋混合3min作为
本研究的最佳涡旋混合时间。
(3)涡旋混合次数的选择在其他条件相同的情况下,样品在涡旋混合4次时,高良姜素及内标的色谱峰响应强度最大,因此选择涡旋混合4次作为本研究的最佳涡旋混合次数。
1.1.3内标的选择与评价在上述色谱条件下,采用大黄素作为内标后,高、中、低三种浓度的高良姜素的分析方法精密度(RSD)分别由外标法的13.22%、9.06%、8.14%(n=5)改善为5.23%、4.56%、6.66%(n=5)。表明采用大黄素作为内标,分析方法更稳定、更精确。
1.1.4血清中高良姜素测定方法学考察高良姜素在1.70～130.05ng范围内线性关系良好;低、中、高浓度组的平均萃取回收率为95.17%(RSD为6.05%);低、中、高浓度组的方法平均回收率分别为106.35%、97.95%、100.07%(RSD分别为6.29%、1.90%、1.17%);日内精密度分别为6.33%、3.89%、0.88%;日间精密度分别为4.16%、3.33%、3.13%;浓度为1.156mg/mL的高良姜素对照品储备液在4℃冰箱保存15天的RSD为1.35%。血清样品在冻融条件下3个周期的RSD为5.45%;在室温条件下10小时的RSD为1.55%;在-20℃冰箱中保存30天的RSD为2.58%,说明该方法灵敏,重现性好。
1.2高良姜素血清药物浓度-时间曲线的测定腹腔注射不同剂量高良姜提取物后,SD大鼠体内高良姜素血药浓度-时间变化趋势均呈二室模型,低、中、高剂量组的消除半衰期(T1/2β)分别为57.98±37.48、5.89±4.18、5.11±1.60h,表面分布容积(Vd)分别为2.77±0.55、1.54±0.92、1.48±0.74L/kg,清除率(CL)分别为0.04±0.02、0.20±0.04、0.20±0.07L/h/kg,浓度时间下面积(AUCO-∞)分别为41.80±19.88、15.04±3.27、23.77±8.62h.mg/L,呈非线性动力学特征。
2.高良姜提取物中高良姜素的排泄研究
2.1排泄物中高良姜素分析方法学考察色谱条件及样品预处理方法同血清样品。排泄物中,高良姜素在4.35～1300.50ng范围内线性关系良好。SD大鼠尿液中,低、中、高浓度组的方法平均回收率分别为97.04%、105.40%、104.13%(RSD为别为1.85%、0.59%、1.70%);日内精密度分别为2.42%、1.15%、0.72%:日间精密度分别为5.31%、1.08%、1.27%。SD大鼠粪便匀浆液中,低、中、高浓度组的方法平均回收率分别为84.21%、111.06%、102.80%(RSD为别为3.27%、0.54%、0.90%);日内精密度分别为6.42%、0.99%、0.71%;日间精密度分别为4.82%、2.05%、5.03%。说明该方法灵敏,重现性好。
2.2排泄实验SD大鼠腹腔注射高良姜提取物(剂量为1.4g生药/kg,折算成高良姜素为2.94mg/kg)后,经尿排出的高良姜素占总给药量的31.2%,经粪便排出的高良姜素占总给药量的3.44%。
3.高良姜提取物中黄酮类化合物的体内代谢产物研究
3.1色谱条件色谱柱:Shim-Pack C18柱(2.1mm×250mm,5.0μm);流动相A相为0.1%乙酸-水,B相为乙腈-甲醇-四氢呋喃(15:40:45);梯度洗脱程序为:0～20 min,39%～61%B;20～30min,61%～100%B;30～4.5min,100%～100%B;流速0.2mL/min,紫外检测波长345nm,柱温:35℃,进样5μL。质谱采用电喷雾接口(ESI),电极电压为-4.0kV,偏转电压-50V,离子源温度250℃,氮气流速4.5L/min,负离子扫描,扫描间隔1s,质荷比(m/z)范围60～800。
3.2体内代谢产物研究高良姜提取物中主要含高良姜素、良姜素、二氢高良姜醇、山奈素-4’-甲醚、乔松素等黄酮类化合物。SD大鼠腹腔注射高良姜提取物后,对各时间段尿液进行LC-MS检测分析,可观察到高良姜素、二氢高良姜醇、山奈素-4’-甲醚等的硫酸酯代谢产物,高良姜素可见甲基化、葡萄糖醛酸甲酯化等代谢产物。
[结论]
1.本研究率先建立了以大黄素为内标物的测定大鼠血清中高良姜素的高效液相色谱分析方法,并应用于大鼠体内高良姜素的血清药代动力学研究,获得了一系列的药代动力学参数。该方法准确度高,稳定性好,符合生物样品的检测要求,为进一步研究高良姜及高良姜中药复方制剂的药代动力学提供了科学手段。
2.本研究采用腹腔注射的给药方式观察高良姜素在体内的药代动力学过程,较以往报道的口服给药方式更接近于静脉注射,减少了首过效应,增加了生物利用度,可更加客观反映高良姜素在体内的药代动力学过程。
3.观察到低、中、高三个剂量组血清中高良姜素的药-时曲线都有三个峰的现象,推测为黄酮类化合物经胆汁排泄形成肝肠循环后所引起的血清药物浓度变化。
4.采用HPLC内标法检测高良姜素的排泄情况,显示高良姜素有31.2%经尿液排泄、3.44%经粪便排泄。
5.采用HPLC-MS检测并分析SD大鼠腹腔注射高良姜黄酮类提取物的代谢产物情况,观察到有高良姜素、二氢高良姜醇、山奈素-4’-甲醚等的硫酸酯化代谢产物,高良姜素的甲基化结合物等。