[目的]下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是由神经分泌大细胞、神经分泌小细胞和自主神经元组成的多功能核团,是下丘脑-垂体-肾上腺轴应激反应的重要整合部位。来自不同脑区的兴奋性谷氨酸能纤维投射到下丘脑室旁核,与神经分泌大细胞(MNCs)形成突触联系,调控MNCs功能活动,并在一定条件下发生可塑性变化,对MNCs功能活动产生长时程调控作用。此外,应激刺激可以影响MNCs的谷氨酸能突触传递及长时程可塑性的形成,但迄今为止,下丘脑室旁核MNCs的兴奋性谷氨酸能突触长时程可塑性的发生机制还不清楚,长期应激对长时程可塑性的影响尚不明确。因此,本研究应用脑片全细胞膜片钳记录结合单细胞RT-mPCR技术,组织化学及神经药理学等手段,研究应激与非应激条件下大鼠下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能突触传递长时程可塑性的诱发机制,探讨应激对下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能突触传递长时程可塑性的影响。[方法](1)非应激大鼠MNCs的长时程可塑性诱导:本部分实验采用出生12-14天的Wistar 雄性大鼠,异氟烷适度吸入麻醉后,迅速断头取脑,用振动切片机制备厚度为250 μm的含有下丘脑室旁核(PVN)的冠状脑片。脑片置于室温的氧饱和(95%02,5%C02)人工脑脊液中孵育1 h以上进行电生理记录。在电压钳下,采用配对电刺激(0.2 ms,10-100 μ A,刺激间隔:50 ms)的方式诱导下丘脑室旁核MNCs的兴奋性突触后电流(evoked EPSCs)并将两个振幅标注为N1和N2。待EPSCs稳定十分钟,利用高频电刺激(100 Hz,100 pulses,3 times)诱导下丘脑室旁核MNCs兴奋性输入的长时程可塑性。通过Axopatch 700B膜片钳放大器及Clampex10.4软件记录并分析电刺激前后神经分泌大细胞的兴奋性突触后流的振幅和配对脉冲比(PPR)的变化情况。电生理记录结束后收集内液进行单细胞RT-mPCR鉴定,确定所记录细胞的分泌类型。脑片用福尔马林固定,进行组织学染色,判断所记录细胞的组织学形态特征。为了记录兴奋性谷氨酸能突触传递与可塑性,本实验所用的人工脑脊液中加入GABAA受体阻断剂picrotoxin和CB1受体阻断剂AM-251,以阻断GABAA和CB1受体介导的抑制性突触传递和长时程抑制。应用KT5720抑制PKA时,需将脑片在KT5720中孵育30 min以上再开始进行记录。应用一氧化氮合酶抑制剂L-NNA时,脑片需灌流L-NNA一个小时后再开始记录。(2)慢性应激大鼠MNCs的长时程可塑性诱导:本部分实验选择出生7-10天的Wistar雄性大鼠,分为慢性束缚应激组和非应激组。慢性束缚应激采用自制的束缚笼进行束缚,每天束缚三小时,连续束缚7天。非应激组不作任何处理。应激开始前和结束后分别测量两组大鼠的体重,计算体重增量。应激结束后剥离胸腺和肾上腺,计算相关胸腺指数和肾上腺指数。电生理记录和长时程可塑性的诱导方式和第一部分相同。电生理结束后,收集内液和固定脑片,鉴定细胞的分泌类型和组织学特征。电生理数据用Clampfit 10.4软件进行分析,所有的实验数据均采用均数±标准误来表示。数据间的统计采用单因素方差分析和秩和检验,P<0.05认为实验组与对照组间具有统计学意义。[结果]第一部分:(1)高频刺激后MNCs的谷氨酸能突触传递出现长时程增强,N1振幅增加40分钟以上,同时伴随双脉冲比值(PPR)下降,表明高频刺激可诱发下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能突触传递长时程增强(LTP)。(2)给予mGluR1阻断剂,对高频刺激诱导的MNCs谷氨酸能LTP没有影响,表明高频刺激诱导MNCs谷氨酸能LTP不是通过mGluR1介导的。(3)阻断NMDA受体活性,高频刺激未能诱导出MNCs的谷氨酸能突触LTP,提示MNCs谷氨酸能突触LTP依赖于NMDA受体。(4)MNCs谷氨酸能LTP可被一氧化氮合酶抑制剂阻断,而一氧化氮供体可以模拟电刺激诱导的MNCs谷氨酸能突触LTP,提示MNCs谷氨酸能突触LTP依赖于一氧化氮的生成。(5)阻断PKA信号通路,高频刺激未能诱导MNCs谷氨酸能突触LTP,提示PKA信号通路介导了高频刺激诱导MNCs谷氨酸能突触LTP。第二部分:(1)慢性束缚应激大鼠的体重增量显著低于非应激组。与非应激组相比,应激组大鼠的胸腺指数降低,肾上腺指数升高。同时,慢性束缚应激处理后,CRF mRNA表达神经元的自发性放电活动显著升高。(2)高频刺激可诱发慢性应激大鼠MNCs的谷氨酸能突触传递产生长时程抑制(LTD),表现为N1的振幅降低,同时伴随PPR升高,表明高频刺激诱导慢性应激大鼠下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能突触传递产生LTD。(3)给予CRF非选择性受体阻断剂,高频刺激未能诱导出应激大鼠下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能突触LTD,提示CRF受体参与高频刺激对应激大鼠MNCs谷氨酸能突触传递LTD的诱导。(4)给予选择性CRFR1阻断剂,增强高频刺激诱导应激大鼠下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能突触传递LTD,而阻断CRFR2导致高频刺激诱导应激大鼠下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能突触传递LTP,提示CRFR1可能介导MNCs谷氨酸能突触传递LTP,而 CRFR2 介导 LTD。(5)阻断PKA信号通路,高频刺激未能诱导应激大鼠下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能LTD,而阻断PKC信号通路后高频刺激仍能诱导MNCs谷氨酸能突触传递LTD,提示高频刺激诱导应激大鼠MNCs谷氨酸能LTD是通过PKA信号通路而不是PKC信号通路介导的。[结论](1)高频强直电刺激诱导大鼠下丘脑室旁核MNCs产生依赖于NMDA受体、NO级联反应和PKA信号通路的兴奋性谷氨酸能突触LTP。(2)慢性应激通过CRF受体,损伤大鼠下丘脑室旁核MNCs谷氨酸能LTP,导致高频强直刺激诱发大鼠下丘脑室旁核MNCs产生PKA信号通路介导的谷氨酸能突触LTD。