论文部分内容阅读
幽门螺杆菌 （Helicobacter pylori, Hp） 的高感染率及其严重的危害性,使Hp疫苗成为医学微生物领域研究的热点之一，为探讨过氧化氢酶（Catalase, KatA）作为基因工程疫苗候选抗原在防治Hp 感染中的作用，本研究采用PCR方法从Hp临床分离株中克隆katA基因（katA），构建Hp过氧化氢酶高效表达载体，并对重组工程菌的表达条件进行优化；重组蛋白KatA（rKatA）经镍离子亲和层析纯化后，以Western blot、ELISA及动物实验检测其免疫学活性。在此基础上，进一步采用重叠延伸技术将大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（E. coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTB）基因（ltB）和katA基因以不同次序进行融合并分别在大肠杆菌中进行表达，筛选较理想的KatA-LTB融合蛋白表达载体，以期获得既具有免疫学活性又具有粘膜佐剂活性的KatA-LTB融合蛋白，为进一步研制Hp分子内佐剂亚单位疫苗奠定基础。全文结果与结论如下：1．采用PCR技术分别从我国临床分离的Hp菌株及国际标准菌株NCTC11637中克隆了Hp katA基因，序列全长1518bp，推定其编码氨基酸505个，与NCTC11637及 GenBank公布的四株 Hp的 katA基因<WP=8>及氨基酸序列比较，碱基一致率大于95% ，氨基酸相同率在97%以上。2．构建了幽门螺杆菌过氧化氢酶表达载体pET-28a-katA。3．确定了工程菌pET-28a-katA/E.coli BL21的最佳表达条件：IPTG浓度500μmol/L、诱导时机OD600≈0.8、诱导时间46 h。在此条件下，rKatA的表达率可达27.41％。4．建立了rKatA的纯化工艺路线。5．rKatA免疫家兔能有效刺激兔抗-KatA IgG产生，该抗体能识别Hp不同菌株的天然过氧化氢酶。6．采用重叠延伸技术获得了不同连接次序的ltB和katA融合基因，并构建和筛选了融合蛋白表达载体，结果表明重组融合蛋白KatA-LTB不仅具有良好的免疫反应性，而且能与GM1神经节苷脂结合，具有潜在的粘膜佐剂活性。