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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种对世界禽类养殖至关重要的病原体之一,而由其强毒株引起的新城疫(Newcastle disease,ND)是一种具有很强的传染性和死亡率极高的禽类疾病。尽管如此,有研究报道新城疫病毒可以在肿瘤细胞中复制并诱导其凋亡,因此关于新城疫病毒这一溶瘤特性被大量的研究。YB-1蛋白(Y-box-binding protein 1,YB-1)是进化上最为保守的核酸结合蛋白之一,YB-1还具有多种生物功能,包括转录调控、翻译调控、耐药性和胞外信号应急反应等。根据最新报道,YB-1与SG(stress granule,即应激颗粒)的形成具有相关性,即YB-1在细胞发生应激反应时会在SG中聚集。在各种各样的细胞压力下,诸如氧化应激、热休克应激、营养缺失、病毒感染等,翻译起始很快的被抑制,在成核蛋白等因子的作用下,形成P小体,进一步聚集化形成应激颗粒,这是细胞的一种防御手段,防止大量的能量消耗在蛋白质的合成。本研究旨在证实新城疫病毒可以诱导宿主细胞YB-1产生聚集化现象,且其位于SG中,而SG的形成与YB-1有密切关系;此外,新城疫病毒可以在转录水平和翻译水平对宿主YB-1进行调控,而YB-1也对病毒的复制产生影响,本论文从最基本地层面对上述机制加以探索和解释。1 YB-1基因分离鉴定及遗传进化分析为了研究人源和禽源YB-1是否也参与了新城疫、禽流感等禽源RNA病毒的感染过程,本研究首先开展了YB-1基因的克隆测序。成功克隆了人源和鸡源YB-1的mRNA完整阅读框序列。通过与哺乳动物的家鼠、两栖类非洲爪蟾蜍和昆虫类的果蝇的YB-1基因比较,结果显示,在核苷酸水平上,人与鸡、家鼠、非洲爪蟾蜍和果蝇的的YB-1同源性分别达到为88.3%、96.1%、80.0%和51.0%,而氨基酸同源性分别为78.9%、97.8%、85.8%和36.5%。分析人和鸡YB-1基因差异,有助于我们了解YB-1在不同种细胞或物种其功能的异同及其原因。结论:人与鸡的YB-1在核苷酸水平上同源性达到88.3%,氨基酸同源性为78.9%,推测具有相同的功能。2 NDV感染对YB-1亚细胞定位影响及其与SG关系研究为了研究YB-1是否参与了新城疫、禽流感等禽源RNA病毒的感染过程,本研究首先通过间接免疫荧光技术检测了YB-1在HeLa和DF-1细胞感染NDV后亚细胞定位变化。根据最新研究报道,YB-1的聚集化现象通常与应激颗粒(stress granules,SG)相关。为了确定NDV感染诱导的YB-1点状聚集与应激颗粒的联系,本研究通过间接免疫荧光技术进一步观察了NDV感染细胞中NP蛋白、YB-1和SG标志物TIA的亚细胞定位;同时,分别使用SG刺激剂亚砷酸钠(sodium arsenite,ARS)和SG抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理细胞调节SG的形成,观察感染病毒后中YB-1的变化。结论:在正常的HeLa细胞中,YB-1主要分布在细胞质,呈较均匀弥散式分布,而YB-1在DF-1细胞却分布在细胞核中。在NDV感染HeLa细胞后,YB-1并没有出现明显的入核现象,而在胞质呈点状聚集。而在NDV感染DF-1细胞中,大量YB-1从细胞核移出,进入细胞质。在这两种细胞中,YB-1均与SG产生共定位,且仅仅极少量的YB-1和SG与NP蛋白共定位,表明病毒感染后,YB-1位于SG之中。在NDV感染的HeLa细胞中,SG的产生被抑制后,YB-1的聚集化现象也随之消失。3新城疫病毒对YB-1的调控作用研究为了研究新城疫感染引起的YB-1胞质内聚集化与NDV增殖的关系及其分子机制,本研究采用RT-qPCR和Western Blot等方法检测NDV感染细胞后,YB-1的转录水平和蛋白水平的变化。随后,我们筛选出一对有效抑制YB-1的siRNA,转染HeLa细胞并利用Western blot检测下调YB-1后NDV的NP蛋白的表达情况。最后,为了确定YB-1在NDV感染过程中是否与宿主和病毒mRNA结合,本研究通过荧光原位杂交(FISH)实验检测了YB-1与病毒及宿主mRNA的亚细胞定位。结论:在HeLa细胞中YB-1的mRNA水平和蛋白水平在NDV感染后出现了明显的下降趋势,在RNAi技术下调YB-1基因表达的HeLa细胞中,NDV NP蛋白的表达水平明显增加;而在禽源DF-1细胞中,随着NDV的感染YB-1基因转录水平却出现上升趋势。FISH实验结果揭示YB-1和宿主mRNA共定位,而与病毒NP的mRNA共定位不明显。