背景:骨损伤是口腔颌面部常见的疾病。肿瘤、炎症、外伤均可引起骨的缺失或破损。随着近年来交通工具的普及及建筑业的高速发展。骨损伤的发病率也大幅上升。骨损伤的治疗中,常常应用钛板或钛钉作为固定物,它们为骨折区提供了有效的力学支持。然而,由于金属内植物缺乏生物活性和其过高强度引起的遮挡效应,仍有一部分患者发生骨折迟愈或不愈、二次骨折、感染等并发症。一些生物可降解材料,如羟基磷灰石、生物陶瓷玻璃、可吸收高分子聚乳酸等,因为其可降解且具有生物活性的特性,被尝试应用于骨损伤的修复。然而,这些材料存在力学强度远低于骨组织和降解率缓慢的问题,使得修复效果往往不尽人意。因此,骨修复物材料的选择对骨损伤的修复效果至关重要。含镁硅酸盐,由于其同时包含了钙、硅、镁元素。已有研究证实,相比于传统的钙磷酸盐(TCP)材料,其在机械性能及促干细胞成骨向分化中有显著的优势。作为生物可降解材料,在降解过程中,它能够释放出成骨所需要的钙、磷离子。此外,它还含有镁离子。镁离子作为人体含量第四的微量元素,近年来已有人探索其在成骨中的作用。有研究利用镁金属或含镁涂层,制造金属骨固定钉。研究发现镁的存在能够抑制破骨细胞活性。还有研究发现金属镁具有抑制炎症相关因子(白介素-1)及影响巨噬细胞行为的功能。长骨的骨髓腔内具有大量的免疫细胞。含镁内植物在长骨骨折修复中发生的成骨、破骨、免疫调节过程中的作用,尚未有系统研究。理想的骨内植物,需要有能够匹配修复区的良好的内外形貌。同时对于长骨骨折、骨缺损来说,更需要修复物有较长的形态和较高的抗弯强度以满足缺损区的跨度需求及力学支持需求。近年来,增材制造技术已被引入组织工程领域,针对各类植入物可进行定制和制造。因此,本课题组希望能够结合增材制造技术,探索高强度生物可降解含镁硅酸盐在骨内植物中的制造工艺与应用效果。研究分以下几个方面展开:1、高强度多孔含镁硅酸盐支架的增材制造、理化特性及体外细胞学检测2、高强度多孔含镁硅酸盐支架修复兔股骨缺损的体内研究3、高强度含镁硅酸盐髓内钉的增材制造、理化特性及体外细胞学检测4、高强度含镁硅酸盐髓内钉修复大鼠胫骨骨折模型的体内研究第一章高强度多孔含镁硅酸盐支架的增材制造、理化特性及体外细胞学检测目的通过增材制造(三维打印)技术设计制备高强度多孔含镁硅酸盐支架,并检测其理化特性和负载细胞的生物学性能。方法化学共沉淀法制备含镁硅酸盐和三磷酸盐(TCP)粉体,X射线衍射(XRD)鉴定粉体组分及纯度。将两组粉体配置成生物可打印墨水,利用挤出式桌面三维打印(3D printing)机器,制造直径6mm高度6mm的圆柱形多孔支架并高温烧结。扫描电镜(SEM)观测支架形态。阿基米德排水法检测支架孔隙率。利用缓冲液系统对其进行体外降解模拟实验。检测支架降解过程中的机械强度、离子释放及溶液p H值变化。将大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)接种于支架上,利用活死染色观察细胞粘附及增殖情况,利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞增殖情况。结果经检测,两组粉体具有典型的晶体曲线。两组支架形态一致,内部孔道具有良好的连通性,孔径均匀～280μm,孔隙率分别为56%(TCP)和53%(含镁硅酸盐)。含镁硅酸盐支架的抗压强度(～71 MPa)是TCP的7倍(～10 MPa)。体外降解实验组中,相对于TCP支架,含镁硅酸盐支架具有更高的的降解率,更多的钙离子释放,以及TCP组所没有的硅离子及镁离子释放。同时还具有更稳定的弱碱性p H值环境以及极高的机械性能(p<0.05)。细胞学实验中,两组均无细胞毒性,对细胞有良好的粘附效果。相较于TCP组,含镁硅酸钙组在第七天时具有更高的促细胞增殖性能(p<0.05)。结论增材制造技术能够稳定制造高强度可降解多孔生物陶瓷支架。含镁硅酸钙支架具有极大的机械性能优势,且能够促进BMSCs的细胞增殖。这为其作为骨缺损修复物提供了可能。第二部分高强度多孔含镁硅酸盐支架修复兔股骨缺损的体内研究目的将第一章所制造的两组支架植入兔股骨缺损。观察其体内成骨效果、机械强度及成骨相关基因表达情况。方法20只成年新西兰雄性大白兔随机分为两组,制备股骨缺损,植入两组支架。术后6周、12周取出样本,行Micro-CT影像学、硬组织切片、抗压强度、成骨相关基因(一型胶原、成骨细胞特异转录因子、骨钙素、Rux相关转录因子2)检测。分析各组骨缺损愈合情况。结果Micro-CT显示,术后6、12周时,含镁硅酸盐支架修复的股骨缺损区的矿化量显著高于TCP组(p<0.01)。硬组织切片显示含镁硅酸盐支架组的新骨生成区域显著大于TCP组(p<0.01)。其各个时间点体内强度也显著高于TCP组(p<0.01)。含镁硅酸盐支架组的组织在6周和12周,表达了更多的成骨相关基因。(p<0.01)结论三维打印制造的多孔含镁硅酸钙支架,在兔股骨缺损区可逐步降解。在促进股骨缺损大量新骨生成的同时,仍保有极高的强度,对缺损区形成了支持。利用增材制造技术结合高强度含镁硅酸盐材料,可以制造出具有临床应用潜力的高强度可降解生物活性支架。第三部分高强度含镁硅酸盐髓内钉的增材制造、理化特性及体外细胞学检测目的研究不同制造参数对含镁硅酸钙髓内钉的形态及力学强度的影响,探索其最优制造参数及力学规律,并对其的微观结构,力学性能,体外生物降解性等进行探究。对可降解含镁硅酸盐对巨噬细胞及骨髓间充质干细胞免疫调节的影响进行研究。方法制造特定组分的高强度含镁硅酸钙生物陶瓷粉体,利用X衍射仪检测其粉体种类及纯度。利用电镜对生产的粉体颗粒形态进行观察。利用不同制造工艺(配置不同PVA百分比的陶瓷墨水、不同的前处理温度程序、不同的烧结温度、不同的后处理程序)制造直径2.3 mm,长度2 cm的含镁硅酸盐髓内钉。采用万能力学机对制造产物的抗弯强度进行检测。在获得最优制造参数后,采用最优制造参数制造不同尺寸(1.1,1.5,1.9,2.3 mm)的含镁硅酸盐髓内钉。对其直径和抗弯强度之间的关系进行数学拟合分析。制造直径1.3 mm、长度2 cm的含镁硅酸盐髓内钉。利用电镜扫描其表面及断端形态。利用X射线能量色散光谱检测其元素分布。使用Tris缓冲液系统对样本进行为期6周的体外降解实验。检测其1,2,3,4,5,6周时的样本失重百分比(%)、溶液p H值变化,以及每个时间点的钙、硅、镁离子释放量。制备高强度可降解含镁硅酸钙片形样本(直径10 mm,高度1 mm),以同样形态的玻璃片做为对照组,分别接种大鼠骨髓间充质干细胞和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7。测定两组样本上大鼠骨髓间充质干细胞的1、4、7天的细胞增殖及7、14天时细胞的成骨分化相关基因(Col-1,Oxterix,OCN,Runx-2)表达。第4、7天时,利用Elisa检测盒测定RAW264.7细胞培养上清液中白介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,利用聚合酶链式反应(PCR)检测RAW264.7细胞M2型极化相关基因(Arg-1,IL-10,TGF-β)和M1型极化相关基因(CD86,TNF-α,i NOS)的表达量。将RAW264.7细胞在两种样本上培养3天后的上清液(条件培养基)收集保存,用于含镁硅酸盐样本上的大鼠骨髓间充质干细胞的培养。测定条件培养下,大鼠骨髓间充质干细胞在含镁硅酸盐样本上的成骨分化相关基因(Col-1,Oxterix,OCN,Runx-2)表达。结果含镁硅酸盐生物陶瓷粉体的XRD谱与wallastonite-2M(PDF#27-0088)吻合。粉体均匀,颗粒大小小于2μm。6%PVA浓度的分散剂比例、3小时快速冷冻前处理程序、1200℃烧结温度以及烧结后逐步降温的制造参数能够显著提升材料的抗弯强度。经拟合分析,CSi-Mg骨修复物的直径与抗弯强度成幂指数关系。(y=1.7783x3.7394,R2=0.9967)。含镁硅酸盐髓内钉具有良好的笔直度和均匀的直径,表面光滑无破损。Ca、Si、Mg元素在其中均匀分布。横断面电镜显示,含镁硅酸盐晶粒发生了良好的融合,晶粒间孔隙均匀。体外降解实验显示,在6周的时间内,样本降解了8.34%±0.61。溶质环境的p H在7.41±0.01至7.81±0.03间浮动。Ca、Si、Mg离子随着样本质量降解,在逐步释放到Tris溶液中。经细胞培养测试显示,第7天时,含镁硅酸盐组大鼠骨髓间充质干细胞的增殖显著高于空白对照(p<0.01)。第3(p<0.05)、7(p<0.01)天时,RAW264.7细胞培养上清液中IL-10的含量显著高于空白对照。而第7天时,RAW264.7细胞培养上清液中上清液中TNF-α的表达量显著低于空白对照(p<0.05)。RAW264.7细胞M2型极化相关基因(Arg-1,IL-10,TGF-β)和M1型极化相关基因(CD86,TNF-α,i NOS)的表达量也表现出相应的显著性改变(p<0.01或p<0.05)。RAW264.7细胞在含镁硅酸盐上培养的上清液能够显著提高含镁硅酸盐上培养的大鼠骨髓间充质细胞的成骨基因表达(p<0.01或p<0.05)。结论本实验通过增材制造结合陶瓷烧结工艺,成功制备全新高强度可降解含镁硅酸盐髓内钉,并探索了其直径与抗弯强度之间的规律,为制造个性化含镁硅酸盐髓内钉提供了参考。含镁硅酸盐可通过离子释放直接促进骨骼组织修复,或可通过影响巨噬细胞的极化而间接影响大鼠骨髓间充质细胞的分化。这为髓内钉在体内调节骨髓腔的微环境,进而促进骨折和骨缺损的修复提供了理论支持。第四部分高强度含镁硅酸盐髓内钉修复大鼠胫骨骨折模型的体内研究目的利用增材制造技术所生产的高强度可降解含镁硅酸盐髓内钉对大鼠胫骨骨折缺损模型进行修复治疗。探究的高强度可降解含镁硅酸盐髓内钉的成骨能力及体内力学变化及骨免疫情况。方法24只成年雄性SD大鼠被随机分成两组。利用钻头在胫骨中段制造2mm左右的皮质骨缺损来建立胫骨骨折模型。利用高强度可降解含镁硅酸盐髓内钉对胫骨骨折模型进行修复。选用同样长度和直径的金属钢钉作为临床对照组,同样对对照组SD大鼠进行手术操作。在1、2、6周时,对修复区进行Micro-CT扫描影像学分析,组织切片染色(HE、col、so、trap、masson-3)分析。对每个时间点的两组样本进行抗弯强度检测和分析。结果在大鼠胫骨骨折模型修复实验中,高强度可降解含镁硅酸盐髓内钉组的各个时间点的新生骨量和抗弯强度显著高于对照组(p<0.01)。在术后6周时,实验组的骨折几乎完全愈合,在三维重建上肉眼已无法观察到骨缺损。组织切片显示,实验组骨折区在6周时有着成熟的骨组织,而对照组则是不成熟的束状骨。TRAP染色显示,早期两组具有较强的破骨活动,而后期实验组骨折区破骨活动更早停止。结论增材制造技术生产的高强度可降解含镁硅酸盐髓内钉能在6周,对大鼠胫骨骨折模型具有良好的修复作用。该种髓内钉不仅能够为骨折区提供良好的力学支撑,还能通过影响破骨活动进而促进骨组织的修复。高强度可降解含镁硅酸盐髓内钉无需二次手术,可能成为一种具有临床应用潜力的骨内植物医疗器械。