阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)即老年性痴呆(senile dementia),是一种以认知和精神状况改变为主要表现的神经系统退行性疾病,主要临床表现有智力下降、人格改变、进行性学习、记忆和注意力丧失。AD的主要病理学特征为：脑内出现高密度的老年斑(senile plaque, SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和神经元丧失等。随着社会人口逐渐老龄化,AD发病率也随之增加,严重威胁老年人的健康和生活质量,给社会带来巨大的人力及财力负担。然而,AD的病因和发病机制目前尚无定论,虽然普遍认为老年斑中的主要成分β-淀粉样蛋白(P-amyloid protein, Aβ)与AD的发病有关,但迄今为止仍缺乏有效清除Aβ或拮抗Aβ神经毒性作用的治疗性药物,攻克AD仍是医学乃至生命科学面临的一项艰巨而紧迫的任务。Humanin(HN)的发现为AD和其它记忆损伤疾病的治疗开辟了一条新的道路。日本东京KEIO大学医学院的Hashimoto教授及其同事根据AD患者的枕叶在发病过程中完好无损这一现象,推测在AD发病过程中,枕叶的神经元一定启动了某种基因的表达。以此为出发点,通过对从AD患者脑的枕叶提取的cDNA文库的表达进行功能监测,他们于2001年发现了一个编码24肽的基因,并将其命名为Humanin (HN)。离体实验证明,这种多肽能有效、特异地抑制多种FAD基因和Ap衍生物诱发的神经元的凋亡,因此被称为神经生存肽。目前,HN的作用机制仍不清楚,但这一发现至少为治疗AD带来了新的启示,人们期待通过对该多肽进行修饰,开发出一种具有美好前景的治疗AD的药物。令人欣喜的是,HN除存在于人染色体外,科学家们已在大鼠、小鼠、猴子、线虫等多种动物体内得到HN的对应物质。caricasole等从大鼠的cDNA文库中鉴别出HN的类似碱基片断,编码一条由38个氨基酸残基组成的多肽(C.末端比HN长14个氨基酸残基),并将其定名为Rattin (RN)。Rattin的发现为利用大鼠模型进行HN实验研究提供了极大便利。本研究在脑内注射Ap制备AD大鼠模型的基础上,对大鼠特异性的HN衍生物——Rattin的神经保护作用进行了系统的行为学、电生理和分子生物学机制研究,旨在为AD的预防和治疗提供一个新的、有效的策略。本研究进行了如下三部分工作：(1)鉴于Morris水迷宫是经典的评价动物空间学习和记忆能力的可靠方法,本研究通过Morris水迷宫行为学试验,观察了双侧大鼠海马内注射Rattin对Aβ31-35所致认知功能伤害的有效逆转效应；(2)鉴于AD患者认知功能下降与Ap伤害突触传递和突触可塑性有关,且海马LTP已被视为学习记忆机制的细胞学模型,本研究利用在体海马CAl区场电位记录手段,在成功诱导兴奋性突触后电位(EPSP)的基础上,观察了Rattin处理对Aβ31-35所致海马LTP压抑的逆转效应；(3)考虑到HN的酪氨酸蛋白激酶机制,本研究以原代培养的大鼠海马神经元为模型,观察了Rattin是否对Aβ31-35片段引起的神经元损伤具有保护作用,并使用Real-time PCR技术观察了酪氨酸蛋白激酶信号通路中MAPK、IP3K和JAK/STAT3三条不同途径在Aβ31-35所致细胞损伤以及Rattin神经保护作用中的贡献,在了解到Rattin可能是通过JAK/STAT3信号通路发挥的神经保护作用后,我们利用流式蛋白定量技术进一步检测了磷酸化STAT3的蛋白表达变化。最后,利用激光共聚焦Ca2+荧光成像技术,观察了Rattin是否对Aβ31-35片段引起的钙超载具有预防和拮抗作用,并利用JAK特异性拮抗剂AG490进一步明确了Rattin保护作用的机制。第一部分Rattin保护大鼠空间学习和记忆功能免受Aβ31-35片段引起的损伤目的：为了阐明Rattin在大鼠脑内的神经保护作用,本研究采用了经典的行为学方法---Morris水迷宫技术观察了双侧海马内注射Rattin对Aβ31-35诱导的大鼠空间学习和记忆功能损伤的影响。方法：选用无视觉和运动障碍的雄性SD大鼠(200-300g),随机分为对照组、Aβ31-35组、高浓度Rattin组以及不同浓度Rattin和Aβ31-35联合注射组,.每组10只。将麻醉后大鼠在脑立体定位仪下,应用微量注射器将Rattin和/或Aβ31-35注入双侧海马内,待动物清醒并恢复两周后,进行Morris水迷宫试验。试验包括定位航行、空间探索和可见平台三部分实验,主要观察药物处理对大鼠逃避潜伏期、游泳距离、大鼠在目标象限(即平台所在象限)游泳所占时间、距离百分比的影响。同时,测定大鼠游泳速度和视力,以排除大鼠的运动和视力障碍对检测指标的影响。结果：(1)Aβ31-35损伤了大鼠空间学习和记忆功能。首先利用连续五天的定位航行试验评估大鼠获取空间信息的学习能力,第六天撤除水下平台后通过空间探索试验检测大鼠的空间记忆能力。结果显示,随着训练日期的延长,各组大鼠寻找水下隐藏平台的平均逃避潜伏期和距离都逐渐减小。但与对照组相比,Aβ31-35组(n=10)大鼠的空间学习能力明显下降,寻找隐藏平台的逃避潜伏期和距离均延长。在训练的第2-5天平均逃避潜伏期分别为55.32±1.68秒(P<0.01),33.54±1.41秒(P<0.01),24.17±0.55秒(P<0.01),和18.38±0.51秒(P<0.01),明显长于对照组(n=10)的28.61±0.99秒,20.61±0.97秒,16.50±0.45秒和14.47±0.52秒。同样,在训练的第2-5天Aβ31-35组大鼠的平均逃避距离延长,分别为685.19±18.68厘米(P<0.01),491.34±13.60厘米(P<0.01),393.80±9.33厘米(P<0.01)和262.05±6.59厘米(P<0.01),明显长于同一时间点对照组的540.11±14.45厘米,349.33±16.30厘米,281.56±13.15厘米和208.92±3.55厘米。空间探索试验中,Aβ31-35组大鼠在目标象限中游泳时间和距离占总时间和总距离的百分比明显减少,分别从对照组的47.63±1.43%和45.09±1.41%下降至29.35±1.09%(P<0.01)和29.26土1.18%(P<0.01)。这些结果提示：双侧海马内注射Aβ31-35严重损伤了大鼠的空间学习和记忆功能。(2) Rattin有效防止了Aβ31-35所致的大鼠空间学习记忆损伤。首先发现,在隐藏平台试验中单独使用即使是高浓度的Rattin (2nmol)都不影响大鼠的逃避潜伏期和距离,目标象限内游泳时间和距离的百分比也没有改变。然而,不同浓度的Rattin (0.02、0.2、2nmol)可以剂量依赖性阻止Aβ31-35所致的空间学习和记忆缺陷。与单独使用Aβ31-35组比较,低浓度Rattin (0.02nmol)+Aβ32-35组(n=10)没有明显改变大鼠的平均逃避潜伏期和距离。但在0.2nmol Rattin+Aβ31-35组(n=10),训练第2-5天的平均逃避潜伏期分别下降至42.11±0.72秒(P<0.01),27.36±0.29秒(P<0.01),20.18±0.50秒(P<0.01),和15.48±0.27秒(P<0.01)；平均逃避距离分别下降至626.58±6.52厘米(P<0.01),427.67±10.77厘米(P<0.01),323.52±4.00厘米(P<0.01),和226.01±2.94厘米(P<0.01)。在2nmol Rattin+Aβ31-35组(n=10)平均逃避潜伏期进一步降至33.15±0.72秒(P<0.01),26.10±0.71秒(P<0.01),18.66±0.55秒(P<0.01)和14.92±0.19秒(P<0.01)；平均逃避距离下降至585.26±9.20厘米(P<0.01),381.80±6.54厘米(P<0.01),306.31±4.34厘米(P<0.01)和208.52±2.15厘米(P<0.01)。与低浓度Rattin (0.02nmol)相比,高浓度Rattin (0.2nmol和2nmol)+Aβ31-35组的平均逃避潜伏期和距离明显降低。在空间探索试验中,不同浓度的Rattin预处理剂量依赖性阻止了Aβ31-35所致的记忆缺失,使大鼠在目标区域的游泳总时间和总距离百分比明显增加,其中在0.2nmol和2nmol Rattin组时间百分比分别增加至36.60±1.67%(P<0.01)和42.71±1.58%(P<0.01),显著高于单独使用Aβ31-35组的29.35±1.09%；这两组的距离百分比分别增加至33.99±1.68%(P<0.05)和39.99±1.81%(P<0.01),高于单独使用Aβ31-35组的29.26±1.18%。上述结果提示单独使用Rattin不影响大鼠的空间认知功能,但不同浓度的Rattin预处理可以浓度依赖性防止Aβ31-35所致空间学习和记忆的损伤。(3)空间探索实验之后进行的可视平台实验显示,各组大鼠逃避潜伏期没有显著差异,到达可视平台的平均时间几乎均为14秒左右。连续5天学习期间,各组大鼠游泳速度也没有统计学差异(P>0.05),平均游泳速度约为19cm/s。这些结果提示,Aβ31-35所致空间学习和记忆的损伤和Rattin的保护作用不是由于大鼠的视力和运动能力发生变化引起的。结论：双侧海马内注射.Aβ31-35能够明显损害大鼠的空间学习和记忆能力,Rattin本身对大鼠的学习、记忆能力没有影响,但是可以剂量依赖性地拮抗Aβ31-35引起的大鼠空间学习记忆能力的损伤。提示脑内HN及其衍生物的高表达或使用外源性合成肽有可能对AD认知功能的下降起到一定的预防和治疗作用。第二部分Rattin保护在体大鼠海马长时程增强免受Aβ31-35引起的损伤目的：利用电生理学手段,在大鼠海马记录场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)的基础上,观察了双侧海马内注射Aβ31-35和Rattin以及二者联合应用对大鼠海马CA1区在体长时程增强(LTP)的影响,旨在探讨Rattin拮抗Aβ31-35神经毒性作用的电生理学机制。方法：在Morris水迷宫试验之后,将麻醉大鼠固定在脑立体定位仪上,在三维推进装置的引导下,将绑定的同心圆双极刺激电极和单极记录电极精确插入到大鼠海马内Schaffer侧枝和CA1区。给予高频刺激(high frequency stimulation,HFS)后,在海马CA1区记录fEPSP,观察各种药物对基础fEPSP和LTP的影响。结果:(1)Aβ31-35抑制了在体大鼠海马CA1区的长时程增强效应。在给予海马内Schaffer侧枝三组高频刺激后,对照组(n=6)的fEPSP平均振幅从最初设定的对照值100%突然增加至187.67±7.24%,并且在高频刺激后一小时仍然维持在150%以上,表明在这种在体实验条件下可成功诱导长时程增强效应。与对照组相比较,注射Aβ31-35(10nmol, n=6)后明显抑制了海马长时程增强效应。高频刺激后0、15、30、60分钟时,fEPSP平均振幅分别从对照组的187.67±7.24%,167.01±1.66%,161.21±2.31%和150.53±3.01%降至165.96±4.11%(P<0.01),133.83±3.25%(P<0.01),126.11±3.94%(P<0.01)和112.14±1.94%(P<0.01)。(2) Rattin注射剂量依赖性地拮抗了Aβ31-35对海马长时程增强效应抑制作用。首先观察到,单独注射Rattin (10nmol, n=6)没有显著改变fEPSP平均幅度。在联合应用不同浓度的Rattin (0.02nmol、0.2nmol和2nmol)和Aβ31-35(10nmol)组中,低浓度(0.02nmol) Rattin没有改变Aβ31-35对LTP的抑制效应。fEPSP振幅在四个不同时间点的百分比分别为165.33±4.08%(P>0.05),138.63±2.43%(P>0.05),125.95±2.33%(P>0.05)和114.01±2.13%(P>0.05),与单独使用Aβ31-35相比有一定增加但是并没有显著性差异。较高浓度(0.2nmol和2nmol)的Rattin可以显著拮抗10nmol的Aβ31-35对LTP的抑制作用(n=6),在0.2nmol Rattin+Aβ31-35组,fEPSP平均振幅在相同时间点分别增加至166.40±5.95%(P>0.05),143.24±4.03%(P<0.05),135.25±3.61%(P>0.05)和124.43±1.54%(P<0.01)；在2nmol Rattin+Aβ31-35组,fEPSP平均振幅在相同时间点增加至172.10±5.21%(P>0.05),145.42±4.45%(P<0.05),136.44±4.23%(P<0.05)和131.48±1.50%(P<0.01),显著高于单独使用Aβ31-35组。该结果提示,较高浓度的Rattin (0.2nmol和2nmol)能有效保护大鼠海马CAl区的突触可塑性。(3) Rattin和Aβ31-35不影响海马的双脉冲易化(PPF)。为了澄清突触前效应是否参与了Aβ31-35和Rattin对突触可塑性的作用,在所有各组HFS之前都检测了海马CA1区的PPF。在Schaffer侧枝给于成对脉冲刺激后,PPF规则性出现,且第二个fEPSP振幅高于第一个fEPSP。在对照组、Rattin和不同浓度的Rattin加Aβ31-35组中PPF比值分别为170.05±5.20%,169.53±3.60%,173.18±2.68%,173.89±2.88%,169.68±3.78%和171.68±3.43%,各组间没有任何显著性差异(P>0.05)。上述结果提示Rattin和Aβ31-35不影响大鼠海马CA1区突触前神经递质的释放。结论：Rattin可以剂量依赖性拮抗Aβ31-35引起的在体大鼠海马CA1区LTP的抑制。Rattin对LTP的保护效应与其行为学的结果保持了高度的一致性,这从电生理角度在解释了Rattin改善大鼠认知功能损伤的可能机制。第三部分Rattin保护海马神经元拮抗Aβ31-35的分子机制研究目的：进一步调查Rattin是否可以抑制Aβ31-35对细胞的毒性作用,并探讨其保护作用是否通过酪氨酸激酶信号通路中的某些途径发挥效应,同时观察Rattin对Aβ31-35诱导的钙超载是否有保护作用。方法：以原代培养的大鼠海马神经元为模型,观察Aβ31-35片段引起的神经元损伤以及Rattin的保护效应,并使用Real-time PCR技术观察酪氨酸蛋白激酶信号通路中MAPK、IP3K和JAK/STAT3三条不同途径在Aβ31-35细胞损伤过程中的作用以及Rattin的神经保护作用；于此同时,采用激光共聚焦Ca2+荧光成像技术,观察Aβ31-35对原代培养的大鼠海马神经元细胞内Ca2+浓度(intracellular calcium concentration,[Ca2+]i)的影响,研究Rattin对Aβ31-35诱导的钙超载的保护作用,进一步利用JAK特异性拮抗剂AG490明确Rattin保护作用的机制。结果：(1)Aβ31-35和Rattin预处理对海马神经元存活率的影响。与对照组相比,Aβ31-35组(11=6)的细胞活性百分比显著减少(42.5±3.3%,P<0.01)；单独给予Rattin,即使在高浓度下(1001μM),对细胞活力也没有影响,细胞存活率仍然为98.3±2.9%(P>0.05)；但Rattin可以剂量依赖性地抑制Aβ31-35介导的细胞毒性作用,与单纯Aβ31-35组相比,低浓度Rattin (1μM)+AP31-35组(n=6)的细胞存活率没有显著性(45.8±2.77%),高浓度Rattin(10μM,100μM)+Aβ31-35组则明显增加,细胞存活率分别为62.23±3.0%(P<0.01)和96.5±4.6%(P<0.01)；给予特异性酪氨酸蛋白激酶抑制剂后,在Genistein+Rattin+Aβ31-35共处理组细胞存活率为44.07±3.65%(P<0.01),较Rattin+Aβ31-35组明显下降。上述结果提示,Rattin可以剂量依赖性拮抗Aβ31-35引起的海马神经元损伤,这种神经保护作用可能与上调酪氨酸蛋白激酶信号通路有关。(2) Rattin和Aβ31-35对酪氨酸蛋白激酶相关信号通路的影响。为了阐明Rattin神经保护作用的分子机制,本实验采用荧光实时定量PCR技术检测了原代海马神经元中MAPK、IP3K和STAT3mRNA的基因表达变化。在单纯Aβ31-35处理组(n=6),STAT3mRNA的表达(0.7226±0.05393)较空白对照组(1.0090±0.07034)显著性下调(P<0.01)；相反,p38MAPK和IP3K mRNA表达水平分别增加到1.2890±0.04055和1.3223±0.0554,较对照组的0.9657±0.05092和0.9647±0.07828显著上调(P<0.01)。与Aβ31-35组相比,100μM Rattin+20μMAβ31-35共处理组中STAT3mRNA的表达水平上调为1.0188±0.11248(P<0.01),而p38MAPK和IP3K mRNA基本未变(1.3647±0.0783和1.2752±0.03528,P>0.05)。这一结果提示,STAT3mRNA基因表达的上调可能与Rattin的神经保护机制有关。(3) Rattin和Aβ31-35对磷酸化STAT3蛋白表达的影响。为了验证Rattin神经保护作用的分子机制确实是通过JAK-STAT3信号通路实现的,本实验采用流式蛋白定量技术检测了原代海马神经元中磷酸化STAT3的蛋白表达变化。在单纯Aβ31-35处理组(11=6),p-STAT3的表达(17.5533±2.8854pg/ml, P<0.01)较空白对照组(43.2467±3.3689pg/ml)显著性下调；与Aβ31-35组相比,100μMRattin+20μM AP31.35共处理组中p-STAT3的表达水平上调为29.8133±2.3655pg/ml (P<0.01)。这一结果提示,p-STAT3蛋白表达的上调可能与Rattin的神经保护机制有关。(4) Rating和Aβ31-35对原代海马神经元细胞内[Ca2+]的影响。将静息状态下(记录后2分钟内)的相对荧光强度设定为1,对照组荧光强度在近30min内没有明显变化,散点图几乎近于水平直线。给予Aβ31-35(n=20)之后,大部分神经元的荧光强度逐渐且显著增加,在记录时间范围内(>20分钟)始终保持持续的高水平,给药后20分钟时[Ca2+]i的相对荧光强度为192.1±2.71%,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。在Rattin(100μM)+Aβ31-35组,Aβ31-35引起的[Ca2+]i水平升高现象被Rattin显著性逆转(120.15±3.6%,n=20,P<0.01)。进一步,给予100μM AG490(JAK抑制剂)预处理30min之后,Rattin的保护效应明显下降。与Rattin+Aβ31-35组相比AG490预处理组的相对荧光强度明显升高(184.07±2.98%,n=20,P<0.01)。提示AG490可以阻断Rattin拮抗Aβ31-35引起的[Ca2+]i超载,说明Rattin的神经保护作用可能与JAK/STAT3途径激活有关。结论：Rattin可以剂量依赖性拮抗Aβ31-35引起的海马神经元损伤,这种神经保护作用与酪氨酸蛋白激酶信号通路中的JAK/STAT3途径,而非MAPK和IP3K途径的激活有关；Aβ31-35的神经毒性与细胞内钙超载有关,Rattiri可以通过激活JAK/STAT3信号通路减轻Aβ31-35引起的细胞内钙超载。因此,激活脑内JAK/STAT3相关信号通路可能将有利于Ap相关的认知障碍的预防和治疗。