论文部分内容阅读
哮喘的发生多与过敏因素有关，免疫因素被认为在哮喘的发病机制中占主导地位。大量的研究表明，多种因素导致的Th1/Th2比例失调是导致免疫调节紊乱的关键。而CD4+T细胞向Th2过度分化过程中，树突状细胞(DC)有重要地位。
未成熟DC活化的具体机制目前并不完全清楚，研究认为NF-κB信号通路是DC活化的必需信号途径。NF-κB的激活是DC刺激T细胞活化的必要条件，DC诱导免疫或耐受的能力与NF-κB活化状态密切相关。做为唯一能够激活原始T细胞的抗原呈递细胞，DC不仅可以活化T细胞，还决定T细胞的分化方向。由于DC及NF-κB在哮喘发病机制中占有重要地位，所以目前针对DC以及NF-κB的免疫治疗研究成为目前哮喘治疗的一个热点问题。
第一部分 NF-κ B圈套寡核苷酸转染对小鼠成熟树突状细胞生物学特性的影响(体外实验部分)
本研究的目的在于观察针对NF-κB的圈套寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)转染对小鼠成熟DC生物学特性的影响，以探讨NF-κB decoy ODN转染DC能否作为免疫耐受性DC，诱导哮喘免疫耐受。
本研究中，体外诱导Balb/C小鼠骨髓细胞生成未成熟DC(imDC)，经抗原卵清蛋白(OVA)以及脂多糖(LPS)孵育后成为OVA冲击的骨髓来源成熟DC(mDC)；将DC分为未转染组(A组)，转染对照组(B组，转染NF-κB mutantODN)以及治疗组(C组，转染NF-κB decoy ODN)，EMSA检测转染后NF-κB的活性变化；流式细胞仪检测各组DC表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)的表达发现，NF-κB decoy ODN转染DC表面共刺激分子CD40、CD80的表达无明显改变，但CD86的表达明显降低。在NF-κB decoy ODN转染组，DC表面CD86表达率为44.84±7.35％，相对于未转染组66.41±7.11％及NF-κ B mutant ODN转染组62.23±6.83％，表达明显下降；混合淋巴细胞反应(MLR)观察各组DC不同细胞密度下(T cell/DC分别为10:1、33：1和100.1)对OVA致敏的T淋巴细胞增殖的影响；液闪计数仪计算上述各组cpm值，A组cpm值分别为：11025±212，8890±254，6670±221，B组cpm值分别为：12054±214，8715±115，6459±221，C组cpm值分别为3568±186，4216±214，5073±195，C组相对于A、B两组差异明显，具有统计学意义。以上结果说明，NF-κB decoy ODN转染DC刺激T细胞的增殖的作用明显减弱。
第二部分 NF-κB圈套寡核苷酸转染对小鼠成熟树突状细胞生物学特性的影响(体内实验部分)
本研究进一步进行体内实验探讨上述转染后DC对哮喘模型小鼠肺脏过敏性炎症的影响。建立小鼠哮喘动物模型，将36只Balb/c小鼠随机分为3组，A组：NF-κB decoy ODN转染DC治疗组；B组：NF-κB mutant ODN转染DC组，做为转染对照；C组：哮喘组，不做任何特殊处理。分别在激发前经尾静脉注射上述DC，观察各组DC对哮喘模型小鼠肺脏过敏性炎症的影响，结果发现，A组相对于B组和C组：①肺泡灌洗液细胞计数分类嗜酸粒细胞比例为9.5±2.3％，相对于B组(20.4±5.6％)和C组(18.6±5.9％)明显下降。②T淋巴细胞因子检测，抑制IL-4(A：95±47pg/ml；B：169±27 pg/ml；C：174±32 pg/ml)和IL-5(A：145±65 pg/ml；B：336±33pg/ml；C：328±35pg/ml)的产生；增加IFN-γ(A：180±60pg/ml；B：59±48pg/ml；C：62±52pg/ml)的产生，差异具有统计学意义。③流式细胞分析表明：A组CD4+IL-4+占总T细胞比例(A：5.2±1.9；B：9.5±2.2；C：9.2±1.9)降低，CD4+IFN-γ+占总T细胞比例(A组：87.9±2.6％；B组：75.1±1.2；C组：74.6±1.8)增加，而IFNγ+/IL-4+比值(A：0.66±0.35；B：0.24±0.16；C：0.22±0.12)显著上升。④比较各组小鼠肺脏组织病理，A组肺脏过敏性炎症明显减轻。以上结果表明NF-κB decoy ODN转染DC能明显减轻哮喘模型小鼠的肺脏过敏性炎症，增强Th1型反应而抑制了Th2型反应。
总结:目前国内外研究中多采用imDC作为载体治疗哮喘，但在基因转染或病毒载体感染的过程中，imDC容易出现成熟化，其导致的结果必然是免疫增强。本研究以mDC为研究对象，探讨通过抑制的NF-κB活性诱导耐受原性DC的可行性。
结果表明：NF-κB decoy ODN转染后的mDC，刺激OVA致敏后的抗原特异性T细胞增殖的能力明显减弱，明显减轻哮喘模型小鼠的肺脏过敏性炎症，增强Th1型T细胞反应而抑制了Th2型T细胞反应，该改良后的DC有望成为哮喘DC疫苗。