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第一部分ARI显著缓解小鼠脂肪肝缺血再灌注损伤目的作为多元醇通路的第一个关键酶,醛糖还原酶(AR)已被越来越多的证据显示能显著加重心、脑、肾等组织的缺血再灌注损伤,但这种作用的机制尚未完全阐明,且其对缺血肝脏特别是脂肪肝的影响尚不清楚。本课题拟在研究AR对缺血脂肪肝的作用并探讨其可能的机制,为临床充分应用脂肪肝这一边缘供体、拓宽供肝来源提供潜在的药物治疗靶点。方法高脂饮食诱导的脂肪肝小鼠予以腹腔注射唑泊司他(ARI组)或者等量生理盐水(Ctrl组)后行1h 70%肝脏阻断及6/24h再灌注,或者腹腔注射唑泊司他后单纯假手术(Sham组),测定肝内TG含量以确认脂肪变的同质性并通过western blot检验AR蛋白表达情况以了解抑制效率;测定血清ALT和AST水平以了解肝功能变化;利用HE切片及扫描电镜评估肝脏结构改变;制备肝细胞悬液后通过流式细胞术检测细胞凋亡或坏死比率;借助于western blot评估肝脏Caspase 3依赖性凋亡情况;通过酶标仪及流式细胞仪检验NAD(P)(H)、GSH/GSSG、MDA、ROS水平,了解唑泊司他对细胞能量代谢、氧化还原状态的影响。结果经高脂饮食诱导后肝脏TG含量在各组小鼠无明显差异,而AR蛋白表达在ARI组显著低于Ctrl和Sham组,抑制效率相较于Sham组和Ctrl组分别为41.3%和33.5%。与Ctrl组相比,AR]I显著改善了 IRI导致的肝脏转氨酶增高、肝结构紊乱及肝细胞坏死凋亡率的增高。同时,ARI在蛋白水平上显著抑制IR所致的Bcl 2下降和BAX上升以及下游的Caspase 3依赖性凋亡通路的激活。另外,ARI的使用明显改善了缺血脂肪肝中的NADPH/NADP与GSH/GSSG比值及ATP含量的减少,降低了肝内MDA、ROS水平。结论ARI对缺血脂肪肝具有明显保护作用;这种作用可能与肝内能量代谢与氧化还原状态的改善和Caspase 3依赖性凋亡通路的激活减少有关。第二部分AR过表达加重人肝细胞L02低氧/再供氧损伤目的研究AR过表达对低氧/再供氧(HR)的人肝细胞株L02的作用并探讨其可能机制。方法通过基因转染pAR构建过表达AR的人肝细胞株L02(pAR组),未转染及转染空质粒的L02分别设为Ctrl和GFP组;置各组肝细胞于高脂培养基诱导其脂肪变性后再于微需氧培养箱中先后予行4h无氧及6h有氧培养,western blot测定AR蛋白含量以评估转染效率;同时生化检测TG含量以评估脂肪变性同质性。通过JC-1染色及荧光显微镜检测HR对线粒体膜势能电位的影响;同时,行蛋白免疫印迹分析Caspase 3依赖性凋亡通路表达水平差异。结果蛋白AR在pAR组相对表达量为0.81±0.12,显著高于GFP组(0.51±0.08)和Ctrl组(0.45±0.09),P<0.05,有显著统计学差异;增强效率较GFP和Ctrl组分别提高58.9%和45.0%。相较于Ctrl和GFP组,AR过表达显著降低了线粒体膜势能电位;在蛋白水平,AR过表达显著抑制了Bcl 2并促进了 BAX以及下游Caspase 3依赖性凋亡通路的激活,。结论AR过表达加重人肝细胞L02低氧/再供氧损伤,这种效应可能与线粒体膜势能电位的降低、线粒体功能障碍和Caspase 3依赖性凋亡通路的过度激活有关。第三部分SDI显著缓解小鼠肝脏缺血再灌注损伤目的研究多元醇通路中第二个关键酶SDH对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的独立作用并探讨其可能机制。方法C57BL/6小鼠予以腹腔注射SDI(CP-470,711)(SDI组)或等量生理盐水(Ctrl组)后行1h 70%肝脏阻断及6/24h再灌注,或者腹腔注射SDI后行假手术(Sham组),western blot测定SDH含量以了解药物抑制效率。检测肝脏功能、组织结构、坏死凋亡情况。同时,行western blot检验蛋白SIRT1及Cleaved-Caspase 3表达情况。另外,通过酶标仪测定NAD(H)、ATP含量以揭示肝脏缺血期无氧酵解情况。结果相较于Ctrl组和Sham组,SDI显著降低了肝脏SDH蛋白水平,抑制效率分别达到46.1%和41.6%;同时,缓解了 I/R诱导的肝功能降低、肝组织结构紊乱、外周血炎性介质升高、肝细胞坏死和凋亡率。在蛋白水平,SDI分别增强和抑制了SIRT1和Cleaved-Caspase 3。另外,SDI组肝脏显示了更高的NAD/NADH比值和ATP含量。结论SDI能显著缓解小鼠肝脏缺血再灌注损伤;这种作用可能与增高的肝脏NAD/NADH比值、ATP含量以及蛋白水平的SIRT1增强和Cleaved-Caspase 3作用有关。