喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，喉部的不典型增生，声带白斑，乳头状瘤等疾病易转化为喉癌。虽早期喉癌的预后较好，五年生存率可达80％以上。但很多声门上及声门下型喉癌经常在较晚期才被发现，五年生存率降至70％，如出现颈淋巴结转移，则降至50％左右，且多数病人不能保留喉功能，生活质量降低。因此研究喉癌前病变与喉癌的关系，早期发现早期诊断喉癌，早期确定颈淋巴结转移对提高喉癌的预后，提高病人的生活质量是至关重要的。下咽癌发生位置隐蔽，生物学特性较恶劣，肿瘤生长迅速，较早出现转移，患者就诊、确诊时大多数已进入中、晚期，预后差。而且随着病程的进展，5年生存率由Ⅰ，Ⅱ期的70-80％降至Ⅲ，Ⅳ期的20％左右。因此早期发现和治疗是提高此病治愈率的关键。近年来肿瘤标志物的研究已成为早期发现肿瘤的手段，蛋白质组学的发展为这一需要提供了可能。蛋白质组学能够动态、整体、定量地考察肿瘤发生过程中蛋白质种类、数量的改变，尤其是组织与体液中所含有的与肿瘤相关的低丰度蛋白，从而发现大量有诊断价值的蛋白标志分子，为肿瘤筛检提供众多的标志物。表面加强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)是一种最新的蛋白质组检测技术，是一种新型的蛋白质芯片系统综合了芯片微阵列技术与质谱两者的优点，大大提高了对蛋白质的鉴定能力，该技术用于生物标志物的发现具有独特的优势。本实验的目的就是采用SELDI-TOF-MS技术，应用WCX2及IMAC芯片来筛选喉癌及下咽癌早期诊断的潜在标志物，建立血清预测诊断模型。并对喉癌前病变及喉癌颈淋巴结转移的血清标志物进行研究，这在国内外文献少见报道。第一部分蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台的建立本研究目的是建立稳定的蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台，优化实验的技术条件。选择喉癌、下咽癌患者血清和组织中分离的肿瘤细胞全蛋白裂解液各8例，采用WCX2、H4、SAX2、IMAC3四种蛋白质芯片，经表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱(SELDI-TOF-MS)测定蛋白质谱，筛选血清和组织细胞裂解液的最佳蛋白质芯片，摸索芯片最佳技术参数，评估该技术的稳定性和可靠性。结果：1．蛋白质芯片显示蛋白质峰质荷比(m／z)主要在1100～30000范围内。2．血清蛋白质图谱显示峰最多的为WCX2芯片，IMAC3其次，而H4和SAX较少。3．细胞蛋白质图谱显示峰最多的为WCX2芯片，H4其次，而IMAC3和SAX较少。4．同一芯片蛋白质峰强度的变异系数(CV)值为0.184731，m／z的CV值为0.000242；不同芯片间蛋白质峰的CV值为0.214244，m／z的CV值为0.000055。第二部分喉癌前病变、喉癌及喉癌颈淋巴结转移相关的血清及组织肿瘤标志物筛选，喉癌诊断预测模型的建立本部分研究目的是应用SELDI-MS-TOF方法筛选喉鳞癌血清蛋白标志物，建立喉癌诊断预测模型。并检测喉部癌前病变及喉癌颈淋巴结转移相关的血清蛋白标志物。收集302例血清标本，其中喉癌病人血清142例，喉部癌前病变57例，正常对照110例。应用弱阳离子交换芯片(WCX2)经表面加强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)测定得到蛋白质谱，通过Biomarker Wizard和Biomarker Pattern(BPS)软件分析喉癌和正常人血清的蛋白质谱差异，建立喉癌诊断预测模型并进行盲法验证。寻找喉部癌前病变及喉癌转移相关蛋白标志物。结果：1．在质荷比(M／Z)2-30KDa范围内，WCX2芯片共检测出18个差异蛋白峰，可以鉴别Ⅰ-Ⅱ期喉癌和正常对照(P＜0.05)。m／z为4176、4286、4477、3160、4969、4094、4119、7774、5341、3665、2409、8060、5912、6452、2048、9288、4347、6116。2．BPS自动选用其中一个差异蛋白质峰(4176)建立决策树模型，灵敏性为86.52％，特异性为84.62％(32／36)。盲法验证的灵敏性为84.91％，特异性为82.22％。3．伴或不伴淋巴结转移的喉癌病人之间检测到14个差异蛋白峰，m／z为2548、4708、2905、6458、4504、9430、4093、3814、2056、3474、4961、4228、13794、2239。4．喉癌前病变与正常对照间有13个差异蛋白而与喉癌之间仅有1个差异蛋白(4532)，13个差异蛋白中有11个与喉癌及正常对照间的差异蛋白相同。第三部分下咽癌血清肿瘤标志物的筛选及诊断预测模型的建立本部分研究目的是应用SELDI-MS-TOF方法筛选下咽癌血清蛋白质分子标志物，并建立诊断预测模型。收集48例下咽癌病人血清，其中36例为建模组，12例为盲法验证组。52例正常对照的血清。其中36例为建模组，16例为盲法验证组。应用弱阳离子交换芯片(WCX2)及固定金属亲和芯片(IMAC3)，经表面加强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)测定得到蛋白质谱，通过BiomarkerWizard和Biomarker Pattern软件分析下咽癌和正常人血清的蛋白质谱差异，建立分类树模型并进行盲法验证。结果：1．在质荷比(M／Z)2000-50000范围内，WCX2芯片共检测出13个差异蛋白(P值以0.05为界)，M／Z为5927、6134、4216、7796、10298、9320、13932、13989、8719、8796、8165、8000、5361。其中8个表达上调，5个表达下调。2．在质荷比(M／Z)2000-50000范围内，IMAC3芯片共检测出21个差异蛋白峰(P值以0.05为界)，M／Z为5971、5909、9505、10277、6114、3881、9298、7773、4646、7845、7978、8148、7937、5339、7571、4069、5243、5136、5868、8339、13903。20个表达上调，1个表达下调。3．选择WCX2芯片两组间强度值相差在两倍以上的差异蛋白峰建立决策树模型，其自动选用7796，4216，5927，5361建立决策树模型，灵敏性为94.44％(34／36)，特异性为88.89％(32／36)。盲法验证的灵敏性为91.67％，特异性为81.25％。结论1．蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术重复性高、稳定性好，是比较理想的蛋白质组学研究技术平台：WCX2，IMAC3是血清蛋白质组研究重要工具，WCX2是组织蛋白质组学研究重要工具；样品的质量控制和操作过程的标准化将直接影响实验结果的可靠性。2．应用SELDI-TOF-MS方法可以从血清中筛选出喉癌及淋巴结转移相关的标志蛋白。建立的喉癌诊断预测模型可能对早期发现早期诊断喉癌具有重要的临床意义。癌前病变与喉癌只有一个差异蛋白而与正常对照有13个差异蛋白，说明部分癌变在喉癌前病变即已经发生，这与喉癌常继发于喉的癌前病变是一致的。3．应用SELDI-TOF-MS方法可以从血清中筛选出下咽癌相关的标志蛋白。建立的决策树模型可能对早期发现早期诊断下咽癌具有重要的临床意义。创新点：1．应用蛋白质芯片进行下咽癌研究为首次：建立了下咽癌的血清蛋白质指纹图谱；首次从血清学建立了下咽癌的诊断预测模型；2．首次对喉癌前病变的血清蛋白质谱进行分析，首次筛选出喉癌颈淋巴结转移相关的血清肿瘤标志蛋白；首次从血清学建立了喉癌的诊断预测模型；3．首次建立了喉癌组织蛋白质组研究的技术平台，找到了恰当的组织处理方法，摸索到结合最佳的蛋白质芯片类型；4．筛选出了部分与下咽癌，喉癌前病变，喉癌及喉癌颈淋巴结转移相关的血清标志蛋白，为今后研究下咽癌，喉癌发生及转移的机制建立了基础。