多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一种由核编码的结构复杂的含铜的氧化还原金属酶,催化酚类物质的氧化,一种以Cu2+为辅基的氧化还原酶。在自然界中广泛存在于植物、人体、动物、微生物等各种生物体中。PPO是引起果蔬褐变的重要的酶之一,果蔬的褐变引起了很大的经济损失。因此,高效新型的PPO抑制剂的开发具有重要的意义。伴随着计算机辅助药物设计、分子生物学和酶学等多领域的迅速发展,合理的药物分子设计已成为新药研发的重要途径。在本研究中,我们根据PPO结构特点,综合运用计算机辅助药物设计、生物活性测定及有机合成等技术对其新型抑制剂先导化合物进行虚拟筛选与合理设计、化学合成、生物活性测定。具体研究内容如下:一、先导化合物的虚拟筛选方面:首先,由于藕的PPO目前晶体结构未解析出来,我们采用甘薯PPO为模板,通过SWISS-MODEL同源模建得到藕的PPO蛋白的三维结构。然后根据已知抑制剂与已报道的PPO酶结构之间的结合模式和作用机制为模板,分析确定了Suflex-Dock和GOLD-Wizard两种对接方法来进行基于藕中PPO靶酶结构的虚拟筛选。根据配体小分子与蛋白质的结合构象及结合力,从7万多个商业化的小分子数据库中筛选出24个潜在活性的化合物,通过Specs公司购买这24个候选化合物,并进行下一步的生物活性测定研究。二、生物活性测定方面:利用紫外吸收分光光度计,通过测定410 nm处的吸光度值来测定PPO的生物活性。对筛选得到的24个候选化合物进行了酶体水平的生物活性测定。实验结果表明,18号化合物对PPO的活性抑制能力最强,其IC50值达到了0.14 mg/mL,与已商品化的PPO抑制剂抗坏血酸的IC50值相当(抗坏血酸为0.12 mg/mL),且18号化合物对接构象及作用机制与参照结构(苯基硫脲)类似。因此,我们将18号化合物作为先导化合物应用于进一步的结构优化设计研究。三、先导化合物的优化设计方面:根据PPO活性位点与抑制剂之间的作用机制,结合参照结构的分子结构特点,对18号化合物的结构进行合理的优化设计,最终确定优化后的目标结构为:N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲。采用一锅法合成21个目标化合物,并进行了IR、1H NMR结构表征。利用同样的生物活性测定方法,对得到的目标化合物进行生物活性测定。实验结果表明,A2的生物活性最高,其IC50值为0.015 mg/mL,与先导化合物相比,抑制率增加了89.29%。四、定量构效关系方面:对合成的21个目标化合物的结构与其PPO活性数据之间进行定量构效关系研究,得到一个相关性显著的3D-QSAR模型:q2=0.607,r2=0.997,N=2,SEE=0.045,F=304.588。模型显示:在R2取代基上引入体积较大的基团,有利于活性的提高;在R1取代基引入含极性原子的基团有利于活性的提高。该模型为进一步的结构的优化设计提供了理论依据。