研究目的肿瘤的早期诊断是影像学亟待解决的问题。随着对肿瘤血管生成分子机制认识的逐渐深入,以肿瘤血管异质性为基础的血管功能性分子标记物不断开发,并应用于肿瘤的分子影像诊断及治疗。KDR作为最重要的血管生长因子VEGF的主要受体,高表达于肿瘤新生血管内皮细胞,在肿瘤血管生成早期阶段起着关键作用。我们以肿瘤血管内皮细胞特异性受体KDR为靶点,借助生物素-亲和素的桥连及信号放大作用,将与KDR有高度结合活性的小肽K237与脂质体微泡偶联,构建靶向微泡(MB_K237),鉴定其理化特性及生物活性,观察靶向微泡对肿瘤新生血管特异性显像作用,以期建立一种新型的肿瘤早期诊断超声分子成像技术。将生物素-亲和素-生物素（BAB）系统引入靶向微泡构建系统,可能克服现有靶向造影剂敏感性和稳定性差的缺点,对靶向造影剂用于其它疾病的诊断有借鉴意义。方法一、靶向微泡MB_K237的制备（一）生物素化脂质体微泡（MB_B）的制备1.二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）,聚乙二醇（PEG）,生物素化脂质（DSPE-PEG2000-Biotin）等脂质材料按一定比例溶解于适量蒸馏水中,同时通全氟丙烷（C3F8）气体,声振至形成乳白色液体,4℃冰箱内静置分层,弃下清,注入相等体积的纯水以纯化微泡,反复纯化2次,去除游离脂质体。2.取微泡溶液以1:10000比例稀释,库尔特颗粒粒度分析仪（MutisizerⅡ,USA）测定微球粒径、微球浓度、粒径分布。（二）制备生物素-亲和素桥介导的携与KDR有高亲和力的小肽的靶向脂质体微泡(MB_K237)1.杭州中肽公司合成荧光标记的生物素化十二肽（FITC-Biotin-K237）,分子量为2523.6D,氨基酸序列为fitc-C6-His-Thr-Met-Tyr-Tyr-His-His-Tyr-Gln-His-His-Leu-Lys（Biotin）。短肽K237是Lei Hetian等人从噬菌体展示肽库分离的一种新的多肽。筛选方法是:以KDR为靶分子,利用亲和技术筛选噬菌体肽库,通过不断降低靶分子的浓度、提高洗涤液的强度和竞争性洗脱法,来获得结合力强的噬菌体克隆。从第2轮筛选的结果中,随机挑选了40个噬菌体克隆扩增,采用ELISA法鉴定它们与KDR的结合活性,挑选与KDR亲和力最高的噬菌体克隆测序,依据测序结果化学制备小肽分子。2.靶向微泡MB_K237的制备:①亲和素-生物素-微泡（Av-MB_B）的制备及检测:MB_B静置纯化后摇匀使成为乳白色混悬液,以0.3ml混悬液（约10⁸个泡）为一个样本,取5组,每组3个样本,每组样本分别加入0μg,2μg、6μg、10μg、30μg荧光标记亲和素（FITC-avidin）构建亲和素-生物素化微泡（Av-MB_B）,孵育30min后静置纯化2次,流式细胞术检测微泡的亲和素携带率,评价出最佳适配剂量。在普通微泡MB和Av-MB_B中分别加入等量FITC标记亲和素孵育30min充分洗涤后,荧光显微镜下观察两种微泡的荧光效果。②.靶向微泡的制备及检测:在MB_B混悬液中按10⁸/ml个微泡加入6μg无荧光标记avidin,孵育30min,静置纯化2次,摇匀,以0.3ml混悬液为一个样本,取7组,每组3个样本,每组分别加入0μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、100μg的FITC-Biontin-k237构建靶向微泡MB_K237,流式细胞仪检测微泡的小肽携带率,评价出最佳适配适剂量。库尔特仪观察MB_K237的物理性状。光镜和荧光显微镜下观察靶向微泡大体外观。二、靶向微泡MB_K237的体外性能鉴定（一）细胞培养及免疫组化染色1.人大肠癌LOVO细胞,人脐静脉内皮细胞（HUVE）和人结肠癌LS174T细胞,取对数生长期,0.25%胰酶消化,接种于6孔板中玻片上（3×10⁵/孔）,加含10%新生牛血清的1640全培液,5%CO2培养箱孵育,直至细胞80%饱和。2.PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定,行常规KDR免疫组化染色。（二）体外靶向实验1.体外结合实验:①将三种细胞（KDR阳性表达强阳性的LOVO细胞、阳性的HUVE细胞、及KDR表达阴性的LS174T细胞）分别与靶向微泡孵育30min,洗涤后光镜下和荧光显微镜下观察MB_K237与三种细胞的结合效果。②将三种微泡（靶向微泡,单纯K237修饰的脂质体微泡,空白微泡）分别与KDR表达强阳性的LOVO细胞孵育30min,洗涤后光镜下和荧光显微镜下观察三种微泡与LOVO细胞的结合效果。2.阻断实验:分别用10μg、50μg的K237与LOVO细胞孵育1h,后将处理过的LOVO细胞与MB_K237孵育30min,洗涤后光镜下观察MB_K237与LOVO细胞的结合效果。3.以Mav=6μg,M_k237=（50μg、70μg、90μg、100μg）的剂量方案制备四种MB_K237,分别与LOVO细胞孵育30min,洗涤后光镜下观察不同MB_K237与LOVO细胞的结合效果。4.以5ml/h、20ml/h,50ml/h,99ml/h微量注射泵模拟体内血流环境,冲洗MB_K237与LOVO细胞形成花环结构,光镜下观察花环结构的变化情况。三、结果判定1.免疫组化结果判定:以细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞判定标准。采用半定量积分法判定结果,阳性细胞数≤5%为0分,6%-25%为1分,26%-50%为2分,51%-75%为3分,>75%为4分;无特异性染色为0分,染色强度黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,两者积分相乘,0-1分为阴性（-）,2-4分为阳性（+）,5以上分为强阳性（++）。2.花环形成率计算:取10个随机视野的细胞总数,每个细胞结合5个或以上的微泡视为花环形成阳性,计算花环形成率。四、统计学处理采用SPSS13.0软件包进行统计分析,实验的计数资料用百分率表示,计数资料比较采用Kruskal-Wills H非参数秩和检验,并Games-Howell检验法进行多重比较,以P<0.05为有显著性差异。五、结果（一）三步法制备靶向微泡1.生物素化脂质体造影剂（MB_B）:MB_B外观呈乳白色,微泡浓度约（2～6.3）×10⁹/mL,平均直径为（2.0～8.3）μm。直径<5μm的微泡不低于94.6%。在200倍光学显微镜下观察,可见微泡径分布均匀,无聚集现象,单个微泡外观圆整。MB_B具有一定的稳定性,4℃冰箱密闭放置,可存放一个月以上,并且保持微泡形态及浓度基本不变。2.亲和素-生物素-微泡（Av-MB_B）:①荧光镜下观察,加入等量FITC-Avdin的两种微泡,经充分洗涤普通微泡（MB）外壳无荧光,Av-MB_B外壳被激发出明亮绿色荧光。②适配剂量筛选:各组微泡-亲和素结合率与亲和素剂量相关,随着亲和素剂量增加携带率呈不同程度逐渐增加,直至达到饱和状态。5组间微泡与亲和素结合率比较:x²=12.767,v=4,P=0.012<0.05,0μg、2μg、6μg、10μg、30μg组微泡与亲和素的结合率有显著性差异,微泡与亲和素的结合成剂量依赖性,随着加入亲和素剂量增加,结合率逐渐升高。Games-Howell多重比较结果,0μg、2μg组有显著性差异（P值为0.000）,6μg、10μg、30μg组任意两组间结合率均差异不显著（P值分别为0.781、0.882、0.793）。说明亲和素—生物素—微泡系统,对于大约10⁸个MB_B,当加入M_AV<6μg时,随着亲和素剂量的增加,结合率逐渐增加,且结合率曲线上升较快;当M_AV≥6μg,结合率曲线进入平台期,增加亲和素的剂量,结合率曲线不再呈显著上升趋势。3.携与KDR有高亲和活性肽K237的靶向微泡(MB_K237的制备:①靶向微泡物理性质:MB_K237外观呈乳白色靶向,微泡浓度约（3～8.4）×10⁸/mL,平均直径为（2.6～8.0）μm。直径<5μm的微泡不低于90.3%。在200倍光学显微镜下观察,可见微泡径分布均匀,无聚集现象,单个微泡外观圆整。荧光显微镜下,靶向微泡外壳激发出明亮的绿色荧光。②靶向微泡的小肽结合率结果:M_AV=6μg、M_k237=（0μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、70μg、100μg）)/10⁸个微泡的剂量比例下,各组微泡的小肽连接率有统计学差异（x²=18.113,v=6,P=0.006<0.05）,认为整体而言7组间有显著性差异;进一步多重比较,连接率较高的第6、7、8组之间两两比较均无统计学差异（P<0.05）,认为当M_k237≥50μg时连接曲线进入平台期。加入KDR高亲和力小肽M_K237=50μg,可使83.4600%±1.58218%的微泡表面带有荧光信号。（二）体外鉴定结果1.细胞培养LOVO细胞生长旺盛,形态良好,典型呈梭形,两端尖细,胞质均匀透明,随时间延长变化不大。HUVECs接种2h后可见贴壁,24h后完全贴壁,细胞均呈短梭形或多角形,排列紧密,似鹅卵石或“铺路石”样,为血管内皮细胞的典型形态。LS174T细胞24h完全贴壁,细胞呈梭形或多边形,呈“团簇状”不均匀分布是该细胞的典型特征。2.免疫组化染色LOVO细胞KDR呈强阳性表达,HUVEC呈阳性表达,阳性物质均定位于细胞膜及胞浆内;LS174T细胞KDR呈阴性表达。3.靶向造影剂的体外鉴定:（1）体外结合实验:①光镜下LOVO细胞周围可见MB_K237围绕细胞或黏附于细胞之上,形成类似花环样结构,,花环形成率平均为90.52%,荧光镜下微泡外壳发出明亮的绿色荧光;人脐静脉内皮细胞（HUVEC）周围可见MB_K237形成的花环结构,花环形成率平均为53.46%,荧光显微镜下微泡外壳发出绿色荧光;对照组LS174T细胞周围可见少许几个微泡黏附,花环形成率为5.57%,荧光显微镜下微泡外壳可见荧光。②MB_K237与靶细胞LOVO结合,花环形成率为87.62%,荧光显微镜下微泡外壳发出明亮的绿色荧光;小肽-微泡复合物（K237-MB_B）与LOVO细胞孵育,花环形成率为1.43%,相对靶向微泡组显著减少,荧光显微镜下可见微泡外壳发出荧光;表面无修饰的空白微泡（MB）与LOVO细胞孵育,仅见几个微泡散在黏附于LOVO细胞周围,但黏附数目<5,花环实验阴性,荧光显微镜下黏附的几个微泡外壳无荧光。2.阻断实验中,10μg封闭组靶细胞周围可见少量MB_K237黏附,50μg封闭组靶细胞周围基本无MB_K237黏附,花环形成率为阴性。3.四种剂量方案分别制备的MB_K237,其靶向效果各组间无明显统计学差异（P>0.05）。4.四种水流速度冲刷下LOVO细胞与MB_K237结合形成的花环样结构逐渐减少。结论携带KDR高亲和活性小肽K237的靶向超声微泡MB_K237造影剂构建成功,能够实现与KDR表达阳性的人大肠癌LOVO细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）特异性结合,且具有一定的稳定性,而与KDR阴性表达的LS174T细胞无特异性结合。有希望实现以KDR为靶点的肿瘤新生血管（如:乳腺癌）的特异性分子显像,为下一步裸鼠乳腺癌移植瘤的对比超声靶向造影的实验研究奠定了基础。