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心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium-Hepatitis Syndrome,HHS）是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型（Fowl Adenovirus serotype 4,FAd V-4）引起的一种严重的禽类传染性疾病,主要病理特征为心包充满淡黄色液体,肝脏泛黄变脆,严重的常伴有点状出血,因最先在巴基斯坦安卡拉地区发现,又名安卡拉病（Angara disease,AD）。2015年HHS在我国开始大面积暴发,给养禽业带来了巨大的经济损失。关于HHS防控研究目前多集中于多克隆抗体制备和灭活疫苗研发,但防控效果还不甚理想。因此,新型疫苗的研发仍然是HHS防控的关键。FAd V-4病毒类似一个20面体,由Penton蛋白、Hexon蛋白和纤突蛋白三个结构蛋白组成,Hexon蛋白构成病毒粒子的面,Penton蛋白构成顶,纤突蛋白则位于病毒粒子表面,类似雷达,识别并吸附宿主细胞,是参与病毒感染的一个结构蛋白。本研究选用纤突蛋白fiber2基因作为研究对象,运用分子克隆技术、生物信息学技术以及基因工程技术对FAd V-4贵州分离株纤突蛋白fiber2基因进行克隆与表达,并对构建的基因工程疫苗进行效果评价,为心包积液-肝炎综合症防控奠定基础。1.安卡拉病毒贵州株纤突基因的克隆及序列分析:根据Gen Bank公布的FAd V全基因序列信息,设计合成包含纤突蛋白fiber2基因的特异性引物,应用常规PCR、分子克隆和生物信息学技术对FAd V-4贵州株（GZ-QL株）纤突蛋白fiber2基因进行克隆测序和生物信息学分析。结果显示,纤突蛋白fiber2基因全长1440bp,共编码479个氨基酸,贵州株（GZ-QL株）与FAd V-4 ON1弱毒株核苷酸之间的同源性为95.9%;与四川SCnj1601强毒株和北京NVD2强毒株FAd V-4核苷酸同源性均为100%;而与其他血清型（1、2、9、11、8a、8b、6、5、）之间的同源性较低,仅有47.2%～50.7%。生物信息学分析结果表明,FAd V-4贵州株（GZ-QL株）纤突蛋白fiber2蛋白属于亲水性蛋白,二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主,无跨膜区域和信号肽区域,是一种非分泌蛋白,整个蛋白抗原性较好且分布均匀。以上研究结果提示,FAd V-4 fiber2基因高度保守且具有良好的抗原特征,可作为构建基因工程疫苗的靶标蛋白。2.安卡拉病毒贵州株fiber2蛋白亚单位疫苗构建:以p MD-19T-fiber2重组质粒为模板,设计含有酶切位点的特异性引物,运用PCR方法扩增fiber2基因,并克隆至原核表达载体p Cold I,构建重组原核表达质粒;转入到Rosetta（DE3）表达宿主菌诱导表达目的蛋白并用SDS-PAGE、Western Blotting对表达蛋白进行分析。结果显示,成功将FAd V-4fiber2基因亚克隆至原核表达载体p Cold I,构建了重组原核表达质粒p Cold I-fiber2;诱导表达蛋白SDS-PAGE分析显示,目的蛋白大小约为55k Da,与预期大小相符;Western-Blotting分析进一步验证了目的蛋白的存在且以主要以包涵体形式表达。应用免疫亲和层析技术对目的蛋白进行纯化,SDS-PAGE和Western Blotting分析显示,获得了纯化的目的蛋白,实现了基于FAd V-4 fiber2蛋白的亚单位疫苗的构建。3.安卡拉病毒贵州株fiber2蛋白核酸疫苗构建:以构建的p MD-19T-fiber2重组质粒为为模板,设计含有酶切位点的特异性引物,运用PCR方法扩增fiber2基因,并克隆至真核表达载体p VAX1,构建真核重组质粒并转染至LHM细胞,经RT-PCR及间接免疫荧光试验（IFA）评价目的体外表达效果。结果显示,成功将FAd V-4 fiber2基因亚克隆至真核表达载体p VAX1,构建了重组真核表达质粒p VAX1-fiber2;重组质粒转染LHM细胞RT-PCR分析显示,目的基因在宿主细胞内实现了有效转录;p VAX1-fiber2转染LHM细胞间接免疫荧光分析可见,宿主细胞内发出fiber2蛋白特异性的绿色荧光,证实目的蛋白在LHM细胞中可得到有效表达。结果表明,成功构建了FAd V-4 fiber2核酸疫苗。4.基于安卡拉病毒fiber2蛋白疫苗实验免疫研究:本试验选取120只7日龄健康雏鸡,分8个免疫组,每组15只,分别为:p VAX1-fiber2核酸疫苗组（50μg、100μg、150μg）、p-fiber2亚单位疫苗组（50μg、100μg、150μg）、灭活疫苗组、0.9%生理盐水对照组。通过肌肉注射方式免疫,初次免疫后每7d加强免疫一次,共免疫3次,每次免疫后第7d采集各组试验动物血样样本,应用ELISA方法评价各组免疫动物体液免疫应答和细胞免疫应答水平。各组动物于最后一次免疫7d后按照104.125TCID50/0.1m L只进行攻毒试验。实验结果显示:三次免疫后亚单位疫苗组、核酸疫苗组和灭活疫苗组均可产生FAd V-4抗体,各疫苗组抗体水平均极显著高于0.9%生理盐水对照组（p<0.01）;第一次免疫一周后,亚单位疫苗组显著高于灭活疫苗组合和核酸疫苗组（p<0.05）,灭活疫苗与核酸疫苗组差异不显著（p>0.05）;二次免疫后一周,亚单位疫苗组与核酸疫苗组显著高于灭活疫苗组（p<0.05）,其中以p-fiber2亚单位疫苗组（100μg）抗体分泌水平最高;末次免疫后一周,亚单位疫苗高于核酸疫苗组与灭活疫苗组,但各组免疫组之间差异不显著（p>0.05）。细胞因子测定结果显示,三次免疫后亚单位疫苗组、核酸疫苗、灭活疫苗组分泌产生的IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ细胞因子水平均显著高于对照组（p<0.05）;亚单位疫苗组和核酸疫苗组均显著高于灭活疫苗组（p<0.05）其中以亚单位疫苗组分泌水平最好;亚单位疫苗组（50μg、100μg、150μg）不同剂量中亚单位疫苗组（100μg）显著高于其他两个剂量。攻毒保护试验结果显示,各疫苗组均对试验动物雏鸡具有一定的保护效果,其中以p-fiber2亚单位疫苗组免疫保护效果最佳。试验表明,基于FAd V-4 fiber2构建的亚单位疫苗、核酸疫苗能诱导试验动物产生体液免疫应答和细胞免疫应答,对FAd V-4感染具有一定的免疫保护作用。