背景:布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病),又被称为波状热、马耳他热等,是一种由布氏菌或称布鲁氏菌(Brucella,简称布鲁菌)感染引起的人畜共患的乙类传染病。布病是现今世界范围内,尤其是在发展中国家流行最广、危害最大的常见人畜共患病之一,其中地中海地区、美国中南部地区、非洲、亚洲、拉丁美洲和中东地区等地区疫情发生较为频繁。人患布病主要是由于人类直接或间接接触病畜,尤其是羊、牛等,以及消费未经充分高压消毒的病畜产品(如羊肉、羊奶等)而导致感染。全球每年新发人布病的病例数超过50万。按照估计,在一些发病率高的国家,该病的发病率甚至可以高达万分之一,且呈逐年上升的趋势。我国从很早就开始对布病的分布情况、病原学特征、发病率、死亡率、流行病学特点和发病机制等方面进行了调查和研究。根据我国卫生和计划生育委员会疾病预防控制局公布的统计数据显示:我国报告的人感染布病的发病率从历史最低的1995年开始迅速增长,并且从2008年开始,每年都有不低于30000例的新增病例,2013年新发布病人数比2008年增加57%,达43486例,最新统计2015年全年发病人数达到56989人次,发病率达到4.1828/100000。我国布病的防治形势日益严峻,急需采取更加积极有力的预防控制措施。布氏菌可以通过人类的消化道、呼吸道或是破损的皮肤等多种途径进入机体,包括屠宰患病牛羊、协助动物分娩、食用未经巴氏消毒的乳制品等,所以与这些高危因素密切接触的职业如兽医、牧民、屠夫等患病率极高。布氏菌进入宿主机体后,大部分会被宿主免疫系统杀死,但残存的细菌可以通过黏附、内生化、侵入、存活和复制传播五个步骤寄生在宿主细胞中,随淋巴液到达淋巴结,然后被巨噬细胞吞噬。但是,由于布氏菌可以抵御细胞内的酸性环境,并且形成躲避吞噬溶酶体的布氏小体,从而拥有在细胞内生存并且复制繁殖的能力。一旦感染,随着时间的发展,大量复制繁殖的布氏菌导致巨噬细胞死亡,细胞破裂释放大量细菌再次进入血液和淋巴液,随之循环至体内肝脏、脾脏等脏器,并对这些组织器官造成感染,引起一系列并发症。由于布病引发的临床症状多且复杂,并极易与流行性感冒、类风湿性关节炎等疾病混淆,根据2012年我国卫生部制定颁发的《布鲁氏菌病诊疗指南(试行)》中的规定,布病的诊断需要结合流行病学史、临床表现和实验室检查三者的结果。布病的常规检疫手段以细菌学和血清学检测技术为主,实验室检查方法中的细菌学检测是布氏菌检测的金标准。然而,从患者血液(骨髓、脓液、关节液等)中进行布氏菌培养较为困难,分离鉴定疑似菌落,至少也要花费10~15天,并且出于生物安全以及实验条件等多方面的考虑,很多医院或诊断机构均不能达到规定要求开展该项检测,造成很多假阴性结果。血清学检测方法,如普遍使用的试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT),主要是通过试剂中的抗原与患者血清中的抗体发生特异性反应,观察凝集现象进行判断,缺点是不能将疫苗接种和自然感染产生抗体的情况加以区分。ELISA是目前检测抗布病抗体最敏感的方法之一,敏感性比SAT高10~100倍,具有操作简便,且检测效果相当,可用于人畜布病诊断的初筛,也可用于慢性布病的诊断,但目前只有用于牛种布病的ELISA是国际贸易中的指定试验。而且,试验靶标多以直接测定与抗原结合的抗体为主,故而在感染早期或抗体滴度较低的时期,很难检测到布病的发生,尤其是在感染布氏菌12~16天内,传统血清学方法无法检测到抗体。另外,很多布病患者并没有明确的流行病接触史,并不像经常接触牛羊的牧民、技术人员和兽医等职业技术人员,会与带病牲畜密切接触,更加不利于医生通过流行病学史进行诊断,所以临床医生对布病的诊断仍然存在一定延误,甚至误诊的情况,尤其在非布病流行的一些南方地区,由于症状与感冒等疾病的症状相似,缺少经验的医生很少联想到布病,进一步影响了患者及时就医的可能,不利于布病的治疗。分子生物学诊断技术,如PCR虽然具有特异性强、灵敏度高、快捷简便等优势,但目前在布病检测方面仍处在实验室试用阶段,没有在临床上得到推广。布病是建国后一直困扰中国畜牧业发展和人民健康的长期问题,是人医和兽医共同防御的重要疾病,因此,对于布病的防治,使用正确、有效的诊断方法刻不容缓。目的:本研究通过制备的羊布鲁氏菌外膜蛋白的单克隆抗体,建立利用免疫荧光技术直接针对布氏菌感染的宿主细胞的检测方法,评估其在临床布病诊断的应用价值,为临床医生提供新的预后判断标准,指导布病治疗。方法:1.研究对象和材料表达OMP25、BP26、OMP31重组蛋白的慢病毒,以及针对羊布鲁氏菌重组外膜蛋白OMP25、BP26以及OMP31的多株单克隆抗体,均由本实验室制备;实验样品来源于黑龙江省农垦总局总医院确诊的154名布病患者的血液样本;布鲁氏菌细菌涂片由广州市疾病预防与控制中心赠予本实验室。2.实验方法(1)筛选用于免疫酶染色的单克隆抗体:使用本实验室制备的5株针对羊布鲁氏菌重组外膜蛋白OMP25单克隆抗体和22株针对OMP31的单克隆抗体,对布鲁氏菌细菌涂片进行免疫酶染色实验。(2)筛选用于免疫荧光检测的单克隆抗体:利用本实验室保存的慢病毒系统,构建含有OMP25、BP26、OMP31基因的慢病毒,并感染真核细胞293FT,得以在细胞内表达OMP25、BP26、OMP31重组蛋白,使用针对以上三种蛋白的单克隆抗体,进行细胞免疫荧光染色实验,并结合本实验室对单克隆抗体与重组蛋白进行其它实验结果(WB、ELISA),筛选出4株可用于免疫荧光检测细胞胞内布氏菌的单克隆抗体,分别是BP26单抗株2A4和5A5,OMP31单抗株2C1和5H3。(3)评估免疫荧光法在临床布病诊断中的应用价值:采集黑龙江省农垦总局总医院感染科154名布病患者的外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs),并采用换液的方式去除悬浮的淋巴细胞,得到较高纯度的单核吞噬细胞,然后利用4株单克隆抗体(2A4,5A5,2C1和5H3),分别对患者单核吞噬细胞内寄生的布氏菌进行免疫荧光的检测。同时,利用ELISA试剂盒、NEST-PCR等技术检测患者血清和细胞中布氏菌的相关抗体和基因,与免疫荧光法作比较分析,评估利用抗羊布氏菌重组外膜蛋白单克隆抗体的免疫荧光法在临床布病诊断中的应用价值。结果:1.用于免疫酶染色的单克隆抗体:使用5株抗羊布氏菌OMP25单克隆抗体和22株抗羊布氏菌OMP31单克隆抗体进行免疫酶染色实验,检测布氏菌单抗与布氏菌天然抗原反应情况。5株OMP25单克隆抗体中3株抗体4A12、6C12、8F3能与天然布氏菌反应,2株抗体2B10、4F10反应为阴性;22株OMP31单克隆抗体中,18株抗体反应呈阳性结果,其中6株抗体2D2,5B1,2C1,4E9,5B3,5H3 为强阳性,6 株抗体 2G9,7A3,8F11,2A8,2B6,5F11 为阳性,6 株 2E7,6D8,4H6,5B11,6F9,11C4 抗体为弱阳性,4 株抗体 1H2,2H5,4H10,6E10为阴性。OMP31单克隆抗体与天然布氏菌反应的阳性率为81.8%,高于OMP25的60%,且OMP31单克隆抗体反应性强于OMP25的抗体。2.用于免疫荧光的单克隆抗体:利用慢病毒系统表达羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP25,BP26和OMP31,并进行免疫荧光筛选能与真核表达的布氏菌蛋白反应的单抗。5株OMP25单克隆抗体均能与真核表达的重组OMP25反应,其中6C12反应性最强。BP26单克隆抗体2A4和5A5都能与真核表达的BP26反应,但3H5反应为阴性。22株OMP31单克隆抗体中,17株单抗反应结果为阳性,其中8株抗体 2C1,2E7,4E9,4H10,8F11,6E10,6F9,11C4 反应性较强,其余 9株抗体 1H2,2D2,2G9,7A3,5B1,2A8,6D8,5B3,5H3 反应性较弱,5 株抗体2B6,4H6,5B11,2H5,5F11不与真核表达的OMP31发生反应。3.Nest-PCR检测布病患者血液中布氏菌DNA:从154份布病患者血清中提取了 DNA及单核吞噬细胞DNA,进行Nest-PCR扩增布氏菌基因片段。154份血清DNA样品中,共有47份样品扩增目的片段成功,阳性率为30.52%;154份单核吞噬细胞DNA样品中,共51份样品扩增目的片段成功,阳性率为33.12%。4.ELISA检测布病患者血清抗体的水平:收集到的154份布病患者血清,使用欣博盛公司生产的BrucellaIgGELISAKit进行检测。根据试剂盒说明书,只有4份样品OD值低于0.9为阴性,约占2.60%;3份样品OD值介于0.9~1.1,约1.95%;147份样品OD值高于1.1为阳性,约95.45%。5.免疫荧光法检测布病患者细胞内携菌情况:收集并分离154份患者外周血中的单核吞噬细胞,免疫荧光检测阳性样品数为106份,阳性率为68.83%,其中OMP31单抗2C1检测阳性样品数为65份,阳性率为42.21%,OMP31单抗5H3检测阳性样品数为89份,阳性率为57.79%;BP26单抗2A4检测阳性样品数为95份,阳性率为61.89%,BP26单抗5A5检测阳性样品数为88份,阳性率为57.14%。结论:本研究建立了利用羊布鲁氏菌重组外膜蛋白的单抗的免疫荧光检测布氏菌的方法,临床诊断布病阳性率为68.83%,远高于该地区医院病原学细菌培养的阳性结果2.6%。免疫荧光法的检测过程相对安全,减少了检测人员细菌培养检测过程中感染布病的风险。单克隆抗体可以扩大培养,生产和纯化,在应对大实验样本量检测的情况下成本更低。本研究建立的免疫荧光法,可检测布病患者血液中单核吞噬细胞中的携菌情况,成为临床布病诊断中弥补细菌学方法的有益补充,对临床医生评估患者治疗效果和预后的判断具有指导价值。