家蚕与野桑蚕CYP6B29基因的克隆、序列分析及原核表达

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细胞色素P450单加氧化酶系在生物体对外源化合物的代谢和内源化合物的调节都起着非常重要的作用,许多证据表明昆虫杀虫剂抗性的产生与单加氧化酶系介导的代谢反应有关,其关键组份细胞色素P450作为终端氧化酶能氧化多样的底物。 以家蚕基因组P450序列为依据,设计了一对引物,采用RT-PCR方法分别以家蚕和野桑蚕中肠为材料提取mRNA,克隆了家蚕CYP6829基因(GenBank登录号:DQ252324)及野桑蚕CYP6829(GenBank登录号:DQ252325)。序列分析表明,家蚕和野桑蚕CYP6829基因编码区长度都为1518bp,编码505个氨基酸,相对分子质量约为58kD,等电点分别为8.29和8.49。同源比较发现两者有12个碱基、6个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸同源性分别达到99.2%和98.8%。经与已知P450的6B亚族其它几乎所有成员氨基酸同源比对发现,家蚕和野桑蚕CYP6829基因与美洲棉铃虫CYP6827同源关系最近,同源性分别达到60.5%和61.3%。P450的6B亚族的许多成员与昆虫对杀虫剂的抗性和植物毒素的代谢相关,因此推测其可能与昆虫抗性相关。 将家蚕和野桑蚕CYP6829基因分别克隆进原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌BL2l细胞中,经1mmol/LIPTG诱导蛋白质表达。SDS-PAGE电泳分析表明在约62kD大小位置,转化家蚕和野桑蚕CYP6829的BL21菌与对照BL21菌和空pET-28a转化BL21菌相比都出现了一条特异性的蛋白质条带,推测家蚕和野桑蚕CYP6829在大肠杆菌中得到表达。然后通过Westernblot分析表明在预期的约62kD大小位置出现较明显的条带,而对照BL21菌和空pET-28a转化BL21菌都没有检测到条带,进一步证明了家蚕和野桑蚕CYP6829得到了成功表达。但在此预期的约62kD大小位置以下出现了几条小分子量条带,而且家蚕和野蚕几乎完全相同。经序列分析表明,这两个基因内部含有大量大肠杆菌稀有密码子,约占到1/10,因此推测这几条较小的蛋白质条带是由于基因的不完全表达造成的。 家蚕和野桑蚕CYP6B29基因的成功表达为进一步通过构建P450体外重组体系,研究对外源物质的代谢,最终确定其功能打下了基础。
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