论文部分内容阅读
目的:骨髓间充质干细胞是一类具有自我更新、多向分化和高度增殖功能的细胞。间充质干细胞的移植能够明显改善肾脏功能,它可能是参与肾小管修复和肾功能恢复的主要细胞群体。而从骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)中提取的微泡(Micro-Vesicles,MVs)具有促进受损肾脏修复的作用。本研究的目的是通过体外实验,观察MSC、MV对受损肾脏细胞的修复作用。方法:利用C57BL/6雄性6周龄小鼠通过全骨髓法分离培养扩增纯化小鼠间充质干细胞,培养至第三代的MSC(P3-MSC)采用流式细胞仪检测细胞表面标记的表达(CD45、CD105)及成脂、成骨诱导分化的鉴定。MSC培养过程中收集MSC培养液,经超速冰冻离心提取MV。体外培养近端肾小管上皮细胞系(HK-2),以浓度为6ng/ml的转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)刺激细胞24或48小时。实验分组:(1)HK-2组,(2)HK-2+TGF-β1(6ng/ml)组,(3)HK-2+TGF-β1+MSCs(1×105 cells/200ul)组,(4)HK-2+TGF-β1+MVs(30μg/ml)组。收集细胞,进行形态学观察,并收集细胞检测平滑肌肌动蛋白-α(α-smooth muscle actina,α-SMA)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)m RNA及其蛋白的表达水平。结果:各组细胞分别经过48、72小时培养,光镜下可见TFG-β1刺激后,细胞凋亡明显增多,细胞间隙增大,细胞纤维化程度明显,呈长梭形,且随着时间的推移,损伤程度明显增加;MSC、MV能够在损伤条件下,减少HK-2细胞凋亡,减轻细胞纤维化程度,细胞间隙未见明显增宽,细胞状态较损伤组明显得到改善。RT-PCR结果显示TGF-β1刺激后,E-cadherin基因及蛋白表达均减少,α-SMA表达增多,且72h表达量多于48h;而MSC、MV组,α-SMA表达明显减少,E-cadherin表达稍降低。结论:骨髓间充质干细胞能够抑制由TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化损伤,并发挥一定的修复作用,而干细胞所提取的微泡能够发挥与之相似的修复作用。目的已有研究表明,骨髓间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cell)可能通过旁分泌机制,而不是由MSC直接作用于损伤部位的方式而减轻受损肾脏功能损伤。进一步研究结果显示,骨髓间充质干细胞提取的微泡(MVs)可能通过细胞之间的通讯而发挥旁分泌机制而发挥相关的生物学功能。本研究的目的是研究MSC、MV在5/6肾大部切除(Subtotal nephrectomy,Nx)小鼠模型中的修复作用。方法将实验小鼠随机分为4组:对照组,Nx组,Nx+MSC组和Nx+MV组。在肾大部切除手术后的第二天,Nx+MSCs组和Nx+MV组通过尾静脉分别注射MSC(1×10^6/小鼠)和MV(30μg/小鼠),之后隔日注射相同剂量。首次给药后第7天处死小鼠,留取肾脏组织、血液标本,检测血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿酸(uric acid,UA)和蛋白尿,以及肾脏的组织病理学分析。结果与Nx组相比较,Nx+MSC组和Nx+MV组的血肌酐、尿酸和蛋白尿的水平显著(p<0.05)降低。损伤后注射MV和MSC的小鼠残余肾呈现较轻微的间质纤维化及淋巴细胞浸润,与未经处理的Nx组相比,肾小管萎缩明显减少。肾大部切除组小鼠的肾脏组织学评分是3.13±0.74,而MSC处理组为1.67±0.47,和MV注射组1.80±0.44,组织损伤程度明显减轻(p<0.01)。结论:本研究显示,MV能够从功能、形态等方面保护受损肾脏,并且与MSCs在肾脏修复中的作用相似。结果表明,MV可能为慢性肾衰竭的治疗提供新的途径。目的:骨髓间充质干细胞(marrow stem cells,MSC)可通过旁分泌作用对受损肾脏发挥修复作用,干细胞来源的微泡(Micro-vesicles,MV)能够传递多种生物活性物质,在修复作用中发挥关键作用,但其修复机制尚未明了;本研究的目的是观察MSC、MV在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠模型中的修复作用,并对其发挥作用的micro-RNA机制进行初步探索。方法:常规方法提取骨髓间充质干细胞,经鉴定、培养、传代,从MSC上在此过程中收集MSC培养液,经超速冰冻离心提取MV。在体外实验中,将实验小鼠分为4组:对照组,单侧输尿管梗阻(UUO)组,MSC治疗组(UUO+MSC),和MV治疗组(UUO+MV)。手术后根据分组分别注射MSC和MV。手术后7或14天处死小鼠,留取标本作进一步生化、病理等检测。此外,利用mi RCURY?Hy3?/Hy5?Power labeling kit and hybridized on the mi RCURY?LNA Array基因芯片技术检测MSC和MV中所携带的micro-RNA,并进行筛选分析。结果:MV和MSC注射组小鼠血尿素氮水平较单侧输尿管梗阻组显著降低(p<0.01,11.3±0.5 vs.9.8±0.7 mmol/L,p<0.01,12.3±1.6 vs.8.7±1.5 mmol/L)。第7天结果显示,MV治疗组血肌酐水平较UUO手术组降低明显(p<0.05,107.1±10.1vs.57.0±10.8 mmol/L)。在第14天,MSC和MV注射组的血肌酐水平较UUO组明显降低:p<0.05,112.1±28.9 vs.75.4±17.7 mmol/L,112.1±28.9 vs.64.2±9.8mmol/L。MV注射组血尿酸水平在第7天、第14天均出现明显降低:p<0.01,227.7±63.7 vs.80.9±26.5 mmol/L;237.0±16.1 vs.78.0±18.9 mmol/L。此外,MSC/MV锁核酸micro-RNA芯片表达谱结果分析显示,共检测到503种mi-RNA有荧光信号的表达,其中MSC中266种,MV中237种,与纤维化相关的micro-RNA包括mi R29,30,200家族等。结论:MV、MSC能够对受损的纤维化肾脏发挥一定的修复作用,从而保护受损肾脏。MV中所包含的某类特定的micro-RNA可能是其发挥修复作用的关键。由此,外源性注射MV可能成为慢性肾脏病治疗的新方法。