背景目前,在世界范围内,结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)发病率居第二位,癌症相关死亡率居第三位,严重危害着人类健康。结直肠癌患者临床表现各异,可以没有症状,也可以有症状,这与发病时间和临床分期有关。无症状患者通常在大便潜血检查结果阳性后行结肠镜检查病理确诊。有症状患者常常表现为直肠出血、腹痛、大便习惯改变、腹部包块、贫血和隐形失血。少数结直肠癌患者首次在急诊就诊,主要表现为梗阻症状,如腹痛腹胀;更有甚者,一旦癌肿破溃穿孔,表现为急腹症征象。此时,大多数患者已是进展期结直肠癌,已失去最佳治疗时机。近几十年来,结直肠癌在诊断和治疗上取得了巨大进步,患者术前行消化系统彩超、结肠镜、胸片和CEA水平检查,如果怀疑存在远处转移情况,推荐行胸腹及颅脑CT检查。直肠癌患者需要加做盆腔MRI检查和直肠超声内镜检查,同时行硬内窥镜检查确定癌灶位置。完善检查后,行术前TNM分期(cTNM stage)评估,选择相应手术方式,有姑息手术或者根治手术。对于pT3-4或者N+直肠癌患者,需要术前行新辅助放化疗,术后行辅助化疗。但是患者预后仍然不尽人意,尤其是发生远处转移的进展期结直肠癌患者[1]。约25%结直肠癌患者在确诊时已存在肝转移,而且约50%患者在术后3年内被发现肝转移[2]。由于大多数结直肠癌肝转移患者已不适合手术,失去根治机会,其预后往往很差,确诊结直肠癌肝转移后5年生存率低于10%[3]。癌胚抗原(CEA)水平可作为随访标志物,但是不能作为可靠的筛选或诊断工具,因为在结直肠癌早期检测中缺乏敏感性和特异性。患者术后随访期间发现CEA水平上升可能预示着结直肠癌复发或者远处转移,需要行CT或者MRI扫描检查来评估肝转移和肺转移情况。目前,在血清及血浆中发现了可能成为结直肠癌肿瘤标志物的LncRNA,对结直肠癌诊断和预后有一定指导意义。此外,还发现有些LncRNA影响结直肠癌对放化疗的敏感性,在理论上可预测治疗效果。因此,为了发展更加有效的早期诊断和综合治疗方法,进一步探索结直肠癌发生、进展及转移的分子机制是很有必要,也是最关键的。目前,基因组学研究已揭示90%以上DNA序列被有效转录,但是仅仅2%转录本编码蛋白质,相比之下,绝大多数转录本被认定为非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)[4]。基因组转录一系列复杂多样的保守ncRNA,包含经典的管家基因,如核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)等,最近鉴定了一系列微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA),这些都是不被翻译成蛋白质的RNA分子。LncRNA由RNA聚合酶Ⅱ转录,长度在200nt和1OOkb之间,而且缺少有效的开放读码框(open reading frame,ORF)[5]。这些和信使RNA(Messenger RNA,mRNA)相似的分子被普遍转录,根据与编码蛋白基因的相对位置被粗略定义为反义LncRNA,并展现了调控基因表达的功能。LncRNA调控基因表达的模式表明了这些分子在不同的生物进程中发挥着作用,包括基因调控、免疫监视和胚胎干细胞多向潜能分化[6-8]。近来,LncRNA发挥作用的分子机制被研究发现与肿瘤发生发展有关,与LncRNA调节紊乱干扰基因表达,抑癌基因失活,激活癌基因等有关[9,10]。AOC4P是长度为2073bp的长链非编码RNA,中文翻译为“含铜胺氧化酶4的假基因”,在肝癌中,LncRNAAOC4P表达降低是疾病预后不良的因素之一,可以作为肝癌的独立预后因子,可能与Vimentin蛋白结合促进其分解,从而抑制上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程[11]。然而,LncRNAAOC4P在结直肠癌中的表达及作用尚不清楚。癌细胞转移级联反应中最具有决定意义的一步就是侵袭能力的获得,包括破坏细胞之间的连接,降解细胞外基质,激活癌细胞支架运动。在过去十几年,研究者已证实了 EMT在癌细胞转移过程中的关键作用,EMT是细胞在受到环境刺激后,通过复杂的膜信号传导,从而发生一系列的外形和功能变化。在EMT过程中,上皮细胞失去极性,并且转化为间质细胞表型,增强癌细胞侵袭能力,同时也能促进细胞生长。EMT进程的启动和进行牵涉到极其复杂的信号转导途径之间的相互作用和相关基因的转录调节,其标志性行为表现为E-cadherin下调,E-cadherin是上皮细胞主要的分子蛋白标志物,受到一系列EMT转录因子调控,这些转录因子包括SNAIL,TWIST和ZEB家族,在胚胎发生和肿瘤形成中均发挥重要作用。此外,这些EMT相关转录因子与癌侵袭和转移,以及预后不良相关,这更加表明EMT在癌发生发展中的重要作用[12]。LncRNAAOC4P是否调节结直肠癌细胞EMT进程,从而影响结直肠癌侵袭浸润和远处转移,这一点尚未见报道。目的本实验通过检测LncRNA AOC4P在结直肠癌组织中的表达,明确与临床病理特征的相关性,同时研究其对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及相关机制,为临床上寻找结直肠癌肿瘤标志物及相关药物作用靶点提供一定理论基础。方法1.采用实时荧光定量PCR检测LncRNAAOC4P在结直肠癌组织以及癌旁相应正常组织中的表达情况,分析LncRNAAOC4P表达与结直肠癌患者临床病理特征的相关性,及与患者生存时间的关系及意义。2.采用实时荧光定量PCR检测CCC-HIE-2和4种结直肠癌细胞株(SW480、HCT166、HT29、SW620)中LncRNAAOC4P的表达水平,进一步确定LncRNAAOC4P在不同细胞株之间的表达差异。将空质粒和LncRNAAOC4P质粒转染结直肠癌细胞建立稳定转染细胞株,CCK-8法检测过表达LncRNAAOC4P后结直肠癌细胞增殖能力的变化,Transwell实验检测过表达LncRNAAOC4P后结直肠癌细胞迁移及侵袭能力的变化。3.采用流式细胞术检测过表达LncRNA AOC4P后结直肠癌细胞凋亡及细胞周期变化,用westernblot检测过表达LncRNA AOC4P后结直肠癌细胞EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin相应表达情况的变化。结果1.结直肠癌组织中LncRNA AOC4P表达与临床病理特征和患者生存情况相关性分析(1)实时荧光定量PCR结果显示,结直肠癌组织中LncRNAAOC4P表达量低于癌旁相应正常组织,两者之间差异具有统计学意义(P<0.05);(2)实时荧光定量PCR结果显示,Ⅰ期及Ⅱ期结直肠癌组织中LncRNA AOC4P表达量高于Ⅲ期及Ⅳ期结直肠癌组织,两者之间差异具有统计学意义(P<0.05);(3)实时荧光定量PCR结果显示,伴有远处转移的结直肠癌组织中LncRNAAOC4P表达量低于不伴有远处转移的结直肠癌组织,两者之间差异具有统计学意义(P<0.05):(4)Kaplan-Meier生存曲线分析显示,结直肠癌组织中较高表达lncRNAAOC4P的患者和结直肠癌组织中较低表达lncRNAAOC4P的患者相比,在相同时间节点总体生存率高,两者之间差异具有统计学意义(对数秩检验log rank test,P<0.05)。COX回归模型分析表明,LncRNA AOC4P低表达是结直肠癌患者预后生存的独立危险因素(P<0.05)。2.LncRNAAOC4P表达对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响(1)实时荧光定量PCR结果显示,四种结直肠癌细胞株(SW480、HCT166、HT29、SW620)中LncRNA AOC4P表达量均比正常粘膜细胞株CCC-HIE-2表达量低,差异均具有统计学意义(P<0.05),其中结直肠癌细胞株SW480和HT29表达相对更低,用于后续实验(2)质粒稳定转染结直肠癌细胞株SW480和HT29效率较高,经实时荧光定量PCR鉴定,成功构建LncRNA AOC4P过表达细胞株。过表达LncRNA AOC4P细胞株与空载体细胞株相比,生长增殖活性受到抑制,两者差异具有统计学意义(P<0.05),其迁移能力和侵袭能力同样减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.LncRNA AOC4P对结直肠癌细胞凋亡、细胞周期及EMT的影响(1)流式细胞术结果显示,LncRNAAOC4P过表达细胞株比空载体转染细胞株凋亡比例高,两者差异具有统计学意义(P<0.05),而两者在细胞周期比例上无明显差异(P>0.05)。(2)westernblot结果显示,LncRNAAOC4P过表达细胞株中Vimentin和N-cadherin比空载体转染细胞株表达减少,两者差异具有统计学意义(P<0.05),而E-cadherin表达量却明显增加,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.LncRNAAOC4P在结直肠癌组织中表达减少,与临床病理特征呈负相关,是患者预后生存的独立危险因素。2.在结直肠癌细胞中过表达LncRNAAOC4P会抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力。3.LncRNAAOC4P过表达促进结直肠癌细胞凋亡,一定程度上削弱了细胞增殖活性;抑制结直肠癌细胞EMT进程,减弱了细胞迁移、侵袭和转移能力。4.LncRNA AOC4P可能成为结直肠癌新的肿瘤标志物和分子生物治疗靶点。