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目的目前,有关脂蛋白与细胞自噬关系的研究主要集中在氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL),研究认为ox-LDL可激活内皮细胞自噬,而天然低密度脂蛋白对自噬的作用尚不清楚。本课题拟研究低密度脂蛋白对内皮细胞自噬的影响并进一步研究其分子机制。方法(1)在培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中转染GFP-LC3质粒,使细胞过表达带有绿色荧光蛋白标记的微管相关蛋白轻链-3(Light chain-3,LC3),在有或无溶酶体抑制剂巴弗洛霉素(Bafilomycin,Baf)存在下,加入50μg/m L低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)作用60min,通过荧光显微镜察看自噬小体数量的改变。(2)用10μg/m L或50μg/mL LDL处理HUVECs 60min,通过Western blot观察不同浓度LDL作用下LC3-II的改变及Akt和mTOR磷酸化的改变。(3)用50μg/m L LDL分别处理HUVECs 5min,10min,30min或60min后,通过Western blot检测LC3-II的改变及Akt和mTOR磷酸化的改变。(4)利用Akt上游分子PI3K的抑制剂LY294002预处理HUVECs,通过Western blot检测LDL对PI3K/Akt信号通路的影响。(5)利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co IP)及Western blot的方法探究胰岛素受体(Insulin receptor,IR)与低密度脂蛋白受体(LDL receptor,LDLR)相互作用关系。(6)用50μg/mL LDL处理HUVECs 5min,10min或30min,通过Western blot观察IR,LDLR及GLUT1在细胞膜及细胞浆中表达量的改变。(7)用50μg/mL LDL与100nM Insulin共处理HUVECs,Western blot检测二者联合作用对PI3K/Akt信号通路,GLUT1在胞膜和胞浆中分布的影响,探究二者的作用是否存在竞争关系。(8)用小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)沉默HUVECs的胰岛素受体后,通过Western blot观察LDL对细胞自噬(LC3)及相应信号通路(pi3k/akt/mtor和pi3k/akt/gsk3β)作用的改变。(9)采用荧光葡萄糖类似物2-nbdg进行细胞葡萄糖摄取实验,观察ldl对细胞摄取葡萄糖功能的影响及其与insulin之间的关系。结果(1)荧光显微镜下,ldl(50μg/ml)引起lc3绿色荧光斑点即自噬小体的明显减少;单独阻断溶酶体功能(bafilomycin单独作用)时,lc3绿点明显堆积;阻断溶酶体功能后,再加入50μg/mlldl作用后自噬小体减少。(2)10μg/ml或50μg/mlldl处理huvecs60min后,lc3-ii表达减少,akt(ser473)及mtor(ser2448)磷酸化增加,均呈浓度依赖性特征。(3)用50μg/mlldl分别处理huvecs5min,10min,30min或60min后,mtor的磷酸化水平随着时间推移而持续增加;akt磷酸化程度在5min时达到最高,其后减弱,但到60min时依然高于对照组;lc3-ii在30min和60min时明显减少。(4)pi3k抑制剂ly294002(5μm)预处理huvecs后可明显抑制50μg/mlldl引起的akt磷酸化增加,及lc3-ii表达下降。(5)免疫共沉淀结果显示ir与ldlr二者作用具有相互性的特征。(6)50μg/mlldl作用5min时,huvecs细胞膜上ir及ldlr的表达明显减少,而胞浆内ir及ldlr的表达显著增加,其后跟着时间变化,含量慢慢回到基线程度;胞膜上glut1含量在5min时显著上升,胞浆内glut1含量变少。(7)单独的ldl(50μg/ml)或胰岛素(100nm)刺激均可激活pi3k/akt/gsk3β和pi3k/akt/mtor通路,且使细胞浆内glut1蛋白向细胞膜转位,前者效应弱于后者,而先用ldl预处理10min后再与胰岛素共作用20min,akt和gsk3β的磷酸化水平及glut1上膜水平介于二者单独作用之间;(8)沉默胰岛素受体可阻断50μg/mlldl引起的lc3-ii表达下降,及akt、mtor和gsk3β的磷酸化水平上调。(9)ldl单独作用促进细胞摄取2-nbdg,其效应弱于胰岛素的作用,二者联合使用,ldl的存在削弱了胰岛素的作用,表现出拮抗作用。结论胰岛素受体通过与低密度脂蛋白受体相互作用,进而介导ldl对PI3K/Akt/m TOR信号的激活,从而抑制内皮自噬。低密度脂蛋白可以促进细胞摄取葡萄糖,但其效应弱于胰岛素,对胰岛素受体产生竞争性拮抗作用,可能与内皮细胞胰岛素抵抗有关。