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研究背景:砷剂的应用已有2000年的历史,在现代医学的实践中,三氧化二砷(As2O3)联合全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)已经成为急性早幼粒细胞白血病(acute Promyelocytic Leukemia,APL)的首要疗法,我国也将晚期肝癌批准为As203的适应症。但是As203容易导致急性出血、消化道功能障碍等急性毒性,以及胃肠道、皮肤和肝脏等组织和器官的不良反应,因此中药资源中的砷类矿物药物雄黄也获得了来自临床的关注。雄黄的化学成分是四硫化四砷(As4S4),上世纪60年代开始在中国被应用于白血病的治疗,以雄黄为主要成分的复方黄黛片联合ATRA在APL中表现出不劣于As203的治疗效果,表明雄黄可作为As203的替代,以规避As203带来的副作用。雄黄应用过程中的一个重大障碍是其水溶性极差,导致生物利用度低,一方面,临床实践中为了获得治疗所需的血砷浓度,常需要大量摄取雄黄,给患者带来健康风险和经济负担。另一方面,由于极低的水溶性,既往基础研究中需采用NaOH溶解雄黄,但是会导致雄黄发生化学变化,增加了机理研究的困难。此外,雄黄的应用研究主要集中于白血病治疗,较少涉及其对实体肿瘤的治疗功效。针对上述问题,本课题制备了亲水性雄黄纳米制剂,以增加其在水中的分散性,提高其生物利用度,并在小鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型和慢性髓系白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)细胞上研究其抗肿瘤功效和机理。研究方法:本研究中将雄黄原粉与两亲性高分子基质共混,通过热熔共挤出技术加工得到亲水性雄黄固体分散体(纳米制剂),通过动态光散射分析其水合粒径分布、扫描透射电镜结合X射线能谱分析纳米颗粒的尺寸和元素分布。通过向小鼠乳腺脂肪垫内原位接种小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1建立小鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型,采用小鼠乳腺癌细胞系和乳腺癌小鼠模型在细胞、组织和整体水平研究亲水性雄黄纳米制剂对乳腺癌的治疗作用;分别给予雄黄纳米制剂、雄黄原粉、高分子基质和生理盐水,评价乳腺癌小鼠肿瘤转移和生存情况,并通过组织化学的方法检测肿瘤组织内的活性氧物种(Reactive Oxygen Species,ROS)、超氧化物歧化酶2(superoxide oxidoreductase 2,SOD2)、缺氧诱导因子 lα 亚基(Hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)、碳酸酐酶 IX(CarbonicanhydraseIX,CAIX)、CD31 和炎性小体NLRP3,通过免疫荧光检测CD31和α-SMA在肿瘤组织内的共定位。采用实时荧光定量PCR的方法检测细胞内BCR-AABL和组织内Hifla、Ldha、Vegfa的转录水平。采用CML细胞系和CML患者骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs),研究亲水性雄黄纳米制剂对CML的作用和分子机制。通过CCK-8法检测亲水性雄黄和雄黄原粉对细胞活率的影响。通过流式细胞术检测细胞增殖、分化、凋亡、胞内ROS和细胞周期分布。采用联苯胺染色检测CML细胞的红系分化。采用电子顺磁波谱仪检测超氧阴离子和羟自由基。采用透射电镜观察自噬小体。采用 Western Blot 检测细胞中 p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、CDC25、p-CDC25、AKT、p-AKT、LC3B、BCR-ABL、CBL、HIF-1α、CD31、CDKNIA 等蛋白水平的影响。结果:1.通过热熔共挤出技术制备了亲水性雄黄纳米制剂,可在水、生理盐水、或缓冲溶液中崩解,形成黄色胶体溶液,溶液中的雄黄颗粒的平均水合粒径在400～700 nm,较雄黄原粉显著减小,在K562细胞、4T1细胞和RAW 264.7细胞中,其细胞毒作用均远高于同等剂量的雄黄原粉。2.亲水性雄黄纳米制剂在细胞水平上降低小鼠乳腺癌细胞4T1和巨噬细胞RAW 264.7活率;在动物水平上减少乳腺癌小鼠的肝和肺转移,延长小鼠生存。机理研究表明,亲水性雄黄纳米制剂具有清除超氧阴离子和羟自由基的能力,可进入肿瘤组织清除其中的ROS,降低肿瘤组织内抗氧化酶SOD2的表达;通过降低Hif1a基因表达而下调肿瘤组织内HIF-1α的表达,从而减少下游Vegfa和Ldha的转录和CAIX的表达,减少血管新生和炎性小体NLRP3;最终实现对缺氧微环境和炎症的调控。3.亲水性雄黄纳米制剂可有效降低CML细胞活率,诱导CML细胞凋亡,抑制CML细胞增殖,阻滞CML细胞周期。在低浓度下,亲水性雄黄纳米制剂可诱导CML细胞系和患者BMMNCs向红系分化。机理研究表明,亲水性雄黄纳米制剂通过磷酸化ERK1/2相关途径导致细胞周期阻滞,通过磷酸化p38 MAPK相关途径诱导红系分化;同时,通过降低细胞内ROS而诱导自噬性降解,使细胞内的BCR-ABL蛋白得到有效减少。结论:亲水性雄黄纳米制剂通过其还原性有效降低了细胞或组织中的ROS水平,从而发挥其抗肿瘤作用。在乳腺癌小鼠模型上有效抑制了肿瘤转移,显著延长了荷瘤小鼠的生存期。同时,亲水性的雄黄纳米制剂不仅获得了更高的细胞毒性,有效诱导K562细胞的周期阻滞和凋亡,而且可以在低浓度下诱导K562细胞和CML患者BMMNCs向红系分化。综上,本研究为亲水性雄黄纳米制剂应用于乳腺癌和CML的治疗及方案优化提供了实验和理论支撑。