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乳链菌肽(Nisin)是由乳酸链球菌发酵产生的一种具有抑菌效果的蛋白质,广泛应用在肉类加工、乳品发酵、罐头生产等方面。相较于人工合成的化学防腐剂,它能被胃肠道内的蛋白酶分解,天然、安全,是一种应用范围很广的细菌素,也是唯一能够用作食品添加的生物防腐剂。除此之外,Nisin还在医疗保健、兽医兽药等领域有着潜在的应用价值,吸引了越来越多研究者的关注。但目前Nisin发酵单产低,使用成本偏高,限制了大规模应用。因此选育Nisin高产菌株、优化培养基、提高产量在实际应用中具有比较高的研究价值。常见的高产菌育种方法有两大类,诱变育种和基因工程育种。诱变育种方法经典,但需要大量重复的诱变筛选工作,费时低效;基因工程育种则具有目的性强,针对性高的特点,更受青睐。乳酸链球菌属于革兰氏阳性菌,细胞壁结构致密,遗传物质受此影响难以进入,降低了转化效率,增加了基因工程操作的难度。因此,有必要对操作过程中的条件参数等进行针对性优化。在本研究中,针对一株Nisin高产菌LS03,首先探究了不同类型的细胞壁弱化剂对转化效率的影响,确定了以氨苄青霉素钠作为弱化剂制备感受态细胞的方法。采用单因素的实验方法,逐个确定了效率最高时的电转化参数,分别为电场强度10kV/cm、频率1500 Hz、电击时间5 ms。测试了不同复苏时间对转化效率的影响,确定细胞复苏所需最佳时间为4 h,该条件下转化效率达到2.5×104 CFU/μg DNA,构建了适合Nisin高产菌株LS03的遗传转化体系。根据文献报道,Nisin生物合成过程关键基因的表达水平与Nisin产量具有关联性。本研究以乳酸乳球菌ATCC11454基因组为模板,将Nisin前体基因nisA克隆到穿梭质粒pMG36e中,构建质粒pMG36e-nisA,并借助前述电转化平台,构建了基因工程菌LS03/pMG36e-nisA。相关检测表明,上述操作成功将原始菌中nisA基因表达水平上调到原来的2.2倍。对比转化前后细菌的生长状态和发酵产量,nisA的过表达会使细菌的生物量降低12%,发酵产量的实验结果表明,前体基因nisA的表达上调使Nisin发酵产量提高了 25%,从出发菌的1901IU/mL提升至 2386 IU/mL。基因工程改造后,nisA基因的表达上调对细菌代谢提出了更高要求,需要对发酵培养基成分进行优化。借助Plackett-Burman设计和响应面分析法,确定了最优的培养基成分为:蔗糖26.50 g/L,酵母提取物10g/L,玉米浆粉10.1g/L,KH2PO4 5 g/L,NaC12 g/L,MgSO4.7H2O 0.2 g/L,吐温-80 1.79mL/L。优化培养基后,Nisin产量提升至2875 IU/mL,较优化前提高了 20%。