研究背景:肿瘤放射治疗(放疗)是利用放射线来控制甚至杀灭肿瘤的一种局部治疗方法,是癌症治疗的三大常规手段之一,在肿瘤的治疗中起着重要的作用。然而放疗在杀灭肿瘤细胞、提高患者生存率的同时,对放疗区域内其他组织也造成了不可避免的损伤,其中放射性骨损伤是较为常见的放疗并发症。放射可以造成骨质疏松、骨萎缩、骨坏死及病理骨折等,文献资料及本实验室的既往研究均表明放射可以导致骨髓内间充质干细胞(MSC)数量减少,并促使其向成脂方向分化。同时,成骨细胞对于放射极其敏感,在接受放射线后迅速凋亡,导致成骨减少,骨质疏松,甚至病理骨折。由于肿瘤病人往往年龄较大并合并其他基础疾病,放疗后发生骨折的风险显著增加,而放疗后骨折往往愈合缓慢,并有很大概率发展为延迟愈合甚至不愈合。文献报道患有软组织恶性肿瘤的患者放疗部位骨折的愈合时间超过一年,骨折不愈合率超过45%,这给患者带来巨大的痛苦,增加死亡率,增加整个社会医疗支出。因此更深入的研究放射性骨损伤发生的机制,探寻有效的预防及治疗措施,成为人们目前研究的重点。目前对于放疗的研究普遍采用小动物全身放疗方式,然而全身放疗对整个身体造成严重损伤,尤其是抑制造血系统,影响骨髓造血并抑制免疫反应,这些因素都极大地干扰了对于实验结果的解释。为了克服这一缺点,美国约翰霍普金斯大学的研究人员研制了小动物精确放疗平台(SARRP)。该平台采用活体多模式图像引导微焦点辐照系统,通过形成高分辨率CT三维影像,进行活体定位,对定位目标进行精准放疗,减少了对周围组织的辐射,可靠、安全、精确、可重复性好,目前已广泛应用于放疗的动物研究。骨折愈合是一个复杂的过程,需要大量的分子、因子与细胞的参与,所有的过程高度协调并有序进行,最终恢复骨骼的正常生理结构及功能。最近的一项研究通过细胞宗谱追踪实验证实参与构成骨痂的细胞大部分来自于骨外膜,在骨折发生后,骨外膜内的祖细胞分裂增殖,并分化为软骨细胞及成骨细胞,进一步形成骨痂。同时组织学研究发现骨外膜分为两层,外层的纤维层和内层的生发层,而参与构成骨痂的祖细胞大部分位于生发层。生发层祖细胞的正常功能受着诸多因素的影响,其中血液供应起到了非常重要的作用。血液循环为骨折愈合提供必要的氧气及养料,并将祖细胞等带入骨痂中,保证骨折愈合的正常进行。同时研究人员发现氧气浓度对于祖细胞的分化能力及分化方向同样具有重要影响。骨折愈合过程中任一环节出现差错,都将对骨折愈合造成影响,据报道约有5%-10%的骨折患者发生骨折延迟愈合的现象,其中很多患者最终发展为骨折不愈合,而骨折不愈合的治疗一直是临床难题。因此在本研究中,我们试图利用小动物精确放疗平台建立放疗后骨折愈合动物模型,通过此模型进一步观察骨折愈合过程并探究其潜在机制。研究目的:我们利用小动物精确放疗平台建立放疗后骨折愈合动物模型,来模拟临床放疗中患者发生骨折,通过分析小鼠骨折的愈合过程,确定放疗后骨折愈合的特点(第一部分),并综合分析影响骨折愈合的因素,进一步探寻放射后骨折愈合的机制(第二部分)。研究方法:第一部分1.动物模型:采用二月龄大雄性C57BL/6小鼠,利用小动物精准放疗平台(SARRP)于小鼠右侧胫骨中段给予8Gy剂量的放射,两天后,相同部位再次接受8Gy的局部放射,剂量总计16Gy。小鼠的左侧胫骨作为未放射对照。放射后2周,于双侧胫骨中段制造横行稳定型骨折,于术后不同时间点处死小鼠并收取胫骨,分别行microCT扫描、组织学及机械力学检测。2.microCT扫描:使用viva CT40扫描收取的胫骨骨折标本,分辨率为10.5μm,根据扫描图像进行二维及三维分析。为计算骨痂中血管体积,行microfil灌注实验,并分别于脱钙前后进行扫描。3.机械力学测试:收取骨折后6周标本行三点弯曲测试,记录受力-位移曲线,并以此曲线计算最大受压力、结构强度、能量吸收值。4.组织学:将于各时间点收取的胫骨骨折标本分别准备石蜡切片或冰冻切片,行番红固绿染色,HE染色,天狼星红染色,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及免疫组化染色(Osteocalcin、、Osterix、二型胶原及Sox9)。5.人类萎缩性骨折不愈合标本:收集人类萎缩性骨折不愈合标本,行石蜡包埋、切片,并行番红固绿染色,HE染色,天狼星红染色及免疫组化染色(Osteocalcin)。6.统计学:所有实验数据均采用平均值士标准差(SD)表示。对于同一小鼠的放射侧(右侧)及未放射侧(左侧)的比较,以及同一胫骨的近端与远端的比较,均应用配对的双尾学生t检验。统计软件采用Prism 5。P<0.05被认为有统计学意义。第二部分1.动物模型:采用二月龄大雄性Col2/Tomato、αSMA/Tomato及Gli1/Tomato小鼠,利用小动物精准放疗平台(SARRP)于小鼠右侧胫骨中段给予8Gy剂量的放射,两天后,相同部位再次接受8Gy的局部放射,剂量总计16Gy。小鼠的左侧胫骨作为未放射对照。放射后2周,于双侧胫骨中段制造横行稳定型骨折,于术后不同时间点处死小鼠并收取胫骨,行组织学检测。2.组织学:将于各时间点收取的胫骨骨折标本分别准备石蜡切片或冰冻切片,行番红固绿染色,HE染色,天狼星红染色及免疫组化染色。对于EdU实验,在小鼠处死前3小时给予EdU注射,收集标本行相应染色。3.细胞学:收取小鼠原代骨外膜细胞,将细胞置于四种不同环境(不放射+正常氧气;不放射+缺氧;放射+正常氧气;放射+缺氧)中,分别行细胞计数、成骨分化及成软骨分化分析,并行染色及实时定量RT-PCR检测。4.统计学:所有实验数据均采用平均值±标准差(SD)表示。对于同一小鼠的放射侧(右侧)及未放射侧(左侧)的比较,以及同一骨的近端与远端的比较,均应用配对的双尾学生t检验。对于细胞学各组之间比较采用非配对的双尾学生t检验,并使用Bonferroni校正法调整。统计软件采用Prism 5。P<0.05被认为有统计学意义。实验结果:第一部分:1.骨折前放疗导致骨折不愈合。通过microCT扫描发现,骨折后6周,未放射组小鼠骨折已完全愈合,骨折线消失,而放射组小鼠仍可见明显骨折线,通过计算骨折愈合指数及三点弯曲试验,进一步证明了放射后骨折不愈合。我们进一步观察到放射组小鼠骨折线近端有骨痂形成,但体积明显较未放射组近端骨痂缩小,而骨折远端未见明显骨性骨痂形成。骨折愈合后期,放射组小鼠近端骨痂向远端生长,但未与远端皮质骨相连,骨折仍未愈合。2.放射造成骨折远端纤维组织积聚。我们进一步行组织学检查,发现放射组小鼠骨折近端骨痂形成延迟,但仍有软骨组织及骨组织形成;骨折远端无骨痂形成,而是大量的纤维组织积聚。该纤维组织中分布有长梭形的细胞,细胞外基质中含有大量的一型胶原。纤维组织持续存在于骨折远端,无法消除,阻碍骨折愈合。3.纤维组织不具有成骨及成软骨分化的能力,缺乏血液供应。对骨痂及纤维组织分别行成骨指标(Osteocalcin及Osterix)及成软骨指标(二型胶原及Sox9)免疫组化染色,结果显示骨痂中可见阳性染色,而纤维组织均为阴性。Endomucin染色及microfil灌注实验证实纤维组织中缺乏血液供应。4.纤维组织与人类骨折不愈合的纤维瘢痕组织具有共同的性质。我们收取人类骨折不愈合的纤维瘢痕组织,行番红固绿染色,HE染色,天狼星红染色及Osteocalcin免疫组化染色,显示纤维瘢痕组织具有同小鼠纤维组织相同的细胞形态,其中无血管形成,细胞外基质中含有丰富一型胶原,无Osteocalcin表达,证实该纤维瘢痕组织与小鼠中形成的纤维组织具有共同的性质。第二部分:5.放射造成骨外膜祖细胞数量减少。在Col2/Tomato小鼠中,骨外膜细胞可以被Tomato荧光蛋白标记,我们收集放射后2周放射组及未放射组小鼠完整胫骨标本,通过荧光显微镜观察骨外膜内荧光分布,证实放射区域内骨外膜祖细胞数量明显减少,而未放射区域并无差别。同时Endomucin染色显示放射区域内血管也明显减少,未接受放射的区域未受影响。6.放射后骨折前期骨外膜反应受到抑制。骨折后三天骨外膜祖细胞分裂增殖,骨外膜增厚。而放射组胫骨骨折两端骨外膜增厚程度减弱,同时行EdU染色同样显示EdU阳性细胞显著减少,证实进行分裂的细胞数目减少,尤以骨折远端为甚。体外实验显示放射及缺氧均可明显抑制骨外膜细胞的成骨分化能力,而缺氧可以非常显著地促进骨外膜细胞的成软骨分化能力。7.纤维组织来自骨骼外的其他组织。我们利用细胞宗谱追踪方法探寻纤维组织的来源。Co12/Tomato及αSMA/Tomato小鼠模型中,Tomato阳性细胞主要分布于骨外膜内层即生发层,而纤维层无阳性细胞,未放射组小鼠骨痂中包含大量的Tomato阳性细胞,证实是由Tomato阳性细胞形成,放射组小鼠近端骨痂仍主要由Tomato阳性细胞构成,而远端的纤维组织为Tomato阴性,证明纤维组织并非来自骨组织。而Gli1/Tomato小鼠模型中,生发层中有少量的细胞为Tomato阳性,大部分的Tomato阳性细胞分布于纤维层,骨折后形成的纤维组织却为Tomato阳性,同时我们未观察到骨折后纤维层有明显的增厚,我们进一步通过手术彻底去除骨外膜,包括纤维层及生发层,并制造骨折,同样观察到相同的纤维组织形成,证实纤维组织来自于骨骼外的其他组织中表达Gli1的细胞。结论:1.骨折前放射造成骨折不愈合,并于骨折远端形成大量纤维组织积聚。2.纤维组织缺乏成骨及成软骨分化能力,缺乏血管,与人类骨折不愈合患者的纤维瘢痕组织具有相同的性质。3.放射造成骨外膜内祖细胞及血管损伤,并抑制骨折后骨膜反应。4.纤维组织来源于骨骼外的其他组织中表达Gli1的细胞。6.我们建立了放射后骨折愈合及萎缩性骨折不愈合小鼠模型,该动物模型稳定性好、手术创伤小,不仅可以用于放疗骨损伤的研究,同时也可以用于萎缩性骨折不愈合的研究。