目的建立先天肾虚仔鼠模型,以Cx43为切入点,观察其骨发育情况,从先天肾精角度验证“肾主骨发育”,初步明确先天肾虚与胎源性骨发育迟缓相关性及Cx43与肾精相关性;采用左归丸含药血清培养原代成骨细胞,阐明Cx43蛋白对先天肾虚影响骨发育的调控机制。方法1)理论研究:阐明肾与骨关系以及先天肾虚影响胎源性骨发育的理论机制。2)体内实验:复制先天肾虚模型仔鼠,雌雄合笼制备30只孕鼠(选用SPF级30只SD雌鼠体重270±20g,15只SD雄鼠体重300±20g,合笼配对),将孕鼠随机分为对照组、模型组、补肾组,每组10只。采用模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓整个孕期,至胎鼠出生,复制先天肾虚仔鼠模型。造模过程中,对照组孕鼠正常喂养给予生理盐水灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;模型组孕鼠模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓同时给予生理盐水灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;补肾组模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓同时给予左归丸灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;仔鼠出生后,为减小后天喂养影响,将每只孕鼠调整相同仔鼠量喂养至5周。取材膜内化骨的颅骨骨缝和软骨内化骨的骨骺生长板两种骨发育典型部位,对先天肾虚骨发育情况,及Cx43、Sox9、PTHrP的分布规律及表达情况进行相关检测。检测仔鼠3周内平均身长、5周内股骨平均长度、Micro CT检测股骨皮质骨及松质骨微结构参数、第5周股骨钙、磷、羟脯氨酸含量研究先天肾虚仔鼠骨发育的情况;取生后第1周仔鼠颅骨骨缝、第3周股骨生长板及第5周股骨皮质骨,石蜡包埋切片,分别采用HE、藩红固绿、马森染色,进行形态学观察;免疫荧光法、RT-PCR技术及WB技术检测Cx43、Sox9、PTHrP的分布规律及表达情况,各组组间进行比较,所得数据均用sx?表示,用SPSS 17.0软件处理,单因素方差分析组间比较,采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。3)体外实验,培养原代成骨细胞,观察细胞增殖、分化、成熟情况,及Cx43表达和其介导的GJIC功能情况。各组原代成骨细胞取材:雌雄合笼制备孕鼠,分为对照组和模型组;模型组给予模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓至仔鼠出生,对照组正常喂养至仔鼠出生;取模型组仔鼠出生当天颅盖骨培养原代成骨细胞,分为模型组细胞和补肾组细胞;对照组仔鼠出生当天颅盖骨培养原代成骨细胞为对照组细胞。制备左归丸含药血清:采用大鼠灌胃左归丸(1.89/Kg)2次/日,连续5天,末次给药1h后,麻醉大鼠提取左归丸含药血清,灭菌、备用。原代成骨细胞培养:三组均用胶原酶消化法获得成骨细胞进行原代成骨细胞培养,差速贴壁法纯化成骨细胞,待细胞铺满瓶底传代培养,对照组和模型组用小牛血清培养,补肾组给予左归丸含药血清培养21D。倒置显微镜连续观察细胞形态;绘制细胞生长曲线(MTT法)、检测分化情况(ALP活性)、检测成熟情况(茜素红染色法);并分别于第7、14、21天检测成骨细胞Cx43蛋白及mRNA表达情况,第21天时免疫荧光染色检测Cx43蛋白表达和划痕染料标记示踪法检测GJIC功能检测,各组组间对比,所得数据均用sx?表示,用SPSS 17.0软件处理,单因素方差分析组间比较,采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1)妊娠期复合恐吓刺激孕鼠,引起孕鼠肾精亏虚无力滋养胎鼠,导致模型组孕鼠胎产数减少(P<0.01或P<0.05),有显著性差异。2)先天肾虚仔鼠平均身长从出生当天到第3周,发现第8天开始至21天身长变短(P<0.05),有明显性差异;第1、3、5周股骨长度变短(P<0.05),组间有明显性差异。3)第1周颅骨骨缝形态学观察,与对照组比较,模型组颅骨骨缝略增宽,骨缝内圆形、卵圆形成骨细胞及其前体细胞数量减少;顶骨骨板变薄,板障空间减少。4)第3周股骨远端生长板形态学观察,模型组股骨生长板增殖层变薄,软骨细胞无序排列,细胞稀疏,补肾组生长板各层软骨细胞与对照组形态排列上无明显差异。先天肾虚仔鼠,先天肾精不足,影响膜内化骨典型部位股骨生长板发育迟缓。5)第5周股骨检测骨矿盐密度,结果发现与骨矿盐密度水平下降相应,模型组骨Ca、P含量减少,各组有明显差异(P<0.01或P<0.05)。股骨干皮质骨胶原纤维马森染色观察股骨基质中Ⅰ型胶原纤维形态,各组在形态学上无明显差异。Micro CT扫描检测通过检测,模型组皮质骨厚度、外径周长、皮质骨面积均下降(P<0.01或P<0.05);扫描远端松质骨微结构发现,模型组在骨小梁厚度、数量、骨体积分数、骨密度上虽有减少表现,但组间比较并无显著性差异(P>0.05)。6)Cx43颅骨骨缝表达结果石蜡包埋切片后行免疫组化检测发现Cx43蛋白在各组织中均染色为棕色,在颅骨骨缝组织中呈高水平表达,主要集中在骨缝边缘区域的成骨细胞及其前体细胞胞浆(成骨细胞、成骨样细胞),与对照组比较,模型组表达降低(P<0.05),有显著性差异,与模型组比较,补肾组表达升高(P<0.05),有显著性差异;WB检测颅骨骨缝Cx43蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细平均灰度值相比较有明显性差异(P<0.01),有显著性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗(P<0.05),有明显性差异;RT-PCR检测颅骨骨缝Cx43 mRNA含量表达:与对照组比较,模型C x43 mRNA含量显著性降低(P<0.05);与模型组比较,补肾组Cx43 mR NA含量显著性升高(P<0.05);对照组与补肾组比较二者无统计学上差异。7)Cx43股骨表达结果石蜡包埋切片后行免疫组化检测:股骨生长板主要在储备层、其次增殖层表达于软骨细胞的胞浆内,各组间无显著性差异(P>0.05);股骨干皮质骨表达于骨小梁边缘成骨细胞及骨基质中的骨细胞胞浆上,各组间无显著性差异(P>0.05);WB检测股骨生长板、股骨皮质骨Cx43蛋白含量:股骨生长板各组条带的粗细和灰度均无明显差异(P>0.05),股骨皮质骨,各组条带的粗细和灰度均无明显差异(P>0.05);RT-PCR检测股骨生长板、股骨皮质骨Cx43 mRNA含量:各组股骨生长板、股骨皮质骨Cx43 mRNA含量组间比较:三组股骨干皮质骨Cx43 m RNA均有表达。与对照组比较,模型Cx43 mRNA含量降低,但不显著性降低(P>0.05),无统计学意义;与模型组比较,补肾组Cx43 mRNA含量升高但不显著性(P>0.05),无统计学意义。8)Sox9股骨生长板表达结果WB检测股骨生长板Sox9蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细平均灰度值相比较有明显性差异(P<0.05),有显著性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗(P<0.05),有明显性差异;RT-PCR检测股骨生长板Sox9 mRNA表达:与对照组比较,模型Sox9 mRNA含量显著性降低(P<0.01);与模型组比较,补肾组Sox9 mRNA含量显著性升高(P<0.01);对照组与补肾组比较二者无统计学上差异。9)PTHrP股骨表达结果WB检测股骨生长板PTHrP蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细,平均灰度值相比较有明显性差异(P<0.05),有显著性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗(P<0.05),有明显性差异。WB检测股骨皮质骨PTHrP蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细平均灰度值相比较有明显性差异(P<0.05),有显著性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗(P<0.05),有明显性差异。RT-PCR检查股骨生长板PTHrP mRNA表达:与对照组比较,模型组仔鼠股骨生长板PTHrP mRNA含量降低,统计学有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,补肾组股骨生长板PTHrP mRNA含量明显升高,统计学有显著性差异(P<0.05);补肾组与对照组PTHrP mRNA含量无明显性差异(P>0.05)。RT-PCR检查股骨皮质骨PTHrP mRNA表达:与对照组比较,模型组仔鼠股骨干皮质骨PTHrPmRNA含量降低,统计学有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,补肾组股骨干皮质骨PTHrP mRNA含量明显升高,统计学有显著性差异P<0.05);补肾组与对照组PTHrP mRNA含量无明显性差异(P>0.05)。10)PTHrP颅骨骨缝表达结果WB检测颅骨骨缝PTHrP蛋白含量:与对照组比较,模型组条带最细平均灰度值相比较有明显性差异(P<0.05),有显著性差异;与模型组比较,补肾组的条带粗细和灰度增粗(P<0.05),有明显性差异。RT-PCR检测颅骨骨缝PTHrP mRNA含量表达:与对照组比较,模型组仔鼠颅骨骨缝PTHrP mRNA含量降低,统计学有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,补肾组颅骨骨缝PTHrP mRNA含量明显升高,统计学有显著性差异(P<0.05);补肾组与对照组PTHrP mRNA含量无明显性差异(P>0.05)。11)颅骨骨缝培养原代成骨细胞MMT法检测成骨细胞增殖和细胞活力,模型组上升趋势缓慢,但各组间比较无显著性差异(P>0.05)。ALP活性检测成骨细胞分化情况,与对照组比较,模型组ALP活性显著性降低(P<0.05);与模型组比较,补肾组ALP活性显著性升高(P<0.05),有明显统计学差异。茜红素染色评估成骨细胞成熟情况,与对照组比较,模型组钙化结节面积显著性降低(P<0.05);与模型组比较,补肾组钙化结节面积显著性升高(P<0.05),有明显统计学差异。12)成骨细胞Cx43蛋白结果Cx43蛋白荧光反应沉积物主要呈线性点片状沿细胞膜表面排列,模型组Cx43蛋白分布减少(P<0.05);Cx43 mRNA表达随着细胞分化的进行,Cx43表达量逐渐增高,第7天模型组略低于对照组和补肾组,但无统计学意义(P>0.05);第14、21天明显低于另两组,P<0.05。Cx43蛋白表达结果与mRNA表达相对应,对照组与模型组对比,差异显著(P<0.05)。13)成骨细胞GJIC功能检测结果各组细胞GJIC功能正常,各组都有荧光黄染料在细胞间的扩散距离;染料扩散面积荧光定量分析显示,与对照组比较,模型组染料扩散面积荧光定量降低,有显著性差异(P<0.01);与模型组比较,补肾组明显增加(P<0.05)。结论本课题从母代肾精亏虚导致子代先天肾虚影响其骨发育的角度进行了理论阐发,首次提出“先天肾虚与胎源性骨病相关”的学术观点;改进了“恐伤孕鼠肾精”以复制先天肾虚仔鼠动物模型方法,发现先天肾虚仔鼠出现骨骼发育迟缓现象;首次以Cx43为切入点,研究先天肾虚影响仔鼠骨发育的机制。本实验立足“恐伤肾”理论,采用妊娠期模拟地震平台复合光电刺激法导致孕鼠肾精亏虚,无力滋养胎儿,成功复制先天肾虚仔鼠模型,观察仔鼠整体骨发育情况,发现模型仔鼠35天内,身长及股骨长均迟缓,故先天肾精与胎源性骨发育迟缓相关;检测颅骨骨缝发育,发现模型组仔鼠颅骨顶骨骨板变薄,颅骨骨缝发育迟缓,Cx43蛋白及mRNA表达均下降,认为Cx43表达下调是影响先天肾虚仔鼠颅骨骨缝发育机制之一;检测股骨发育,股骨远端骨骺生长板增值层变薄,Cx43表达无明显变化,但是局部PTHrP表达及Sox9表达下调,故先天肾虚仔鼠股骨发育迟缓与局部PTHrP表达及Sox9表达相关;培养原代成骨细胞,发现先天肾虚影响成骨细胞分化、成熟,Cx43表达下降,其介导GJIC下降,故Cx43介导GJIC调控成骨细胞分化成熟是影响颅骨骨缝膜内成骨的可能分子机制之一;补肾组为左归丸能治疗妊娠期肾精亏虚,结果显示身长发育增快,故认为左归丸预防子代儿童期骨发育迟缓,其部分作用机制是调节Cx43介导GJIC阻断仔鼠骨发育迟缓。结论归纳如下:1)妊娠期复合法恐吓刺激孕鼠,影响先天肾虚仔鼠骨发育,故先天肾精与胎源性骨发育迟缓相关。2)Cx43表达下调是影响先天肾虚仔鼠颅骨骨缝发育机制之一。3)Cx43介导GJIC调控成骨细胞分化成熟是影响颅骨骨缝膜内成骨的可能分子机制之一。4)肾精与Cx43介导GJIC功能一致,影响膜内化骨调控骨生长发育,因此,Cx43是肾精的物质基础之一。5)左归丸能治疗妊娠期肾精亏虚,预防其子代儿童期骨发育迟缓。6)Cx43介导GJIC功能是左归丸补肾填精的作用机制之一。7)先天肾虚仔鼠股骨发育迟缓与局部PTHrP表达及Sox9表达相关。