论文部分内容阅读
研究背景和目的：脊髓损伤(spinal cord injuries，SCI)是一种严重威胁人类健的疾病，由于脊髓损伤后极难再生，因此较难治愈，给社会及家庭带来严重的经济、精神负担。目前治疗脊髓损伤的效果仍不理想，缺乏有效的治疗方法，脊髓损伤修复一直是医学界的研究热点，传统的观点认为中枢神经系统损伤后，由于神经元变性坏死以及外环境的抑制作用，神经元损伤后不可能再生。1981年Aguayo等通过他们实验证实在在合适的环境中损伤后的中枢神经轴突可以再生，让各国学者对脊髓损伤修复研究再一次看到了希望。SCI后轴突再生困难的原因复杂，目前主要认为有以下几点：(l)脊髓的直接及继发损伤致使神经元变性坏死或凋亡;(2)脊髓损伤破坏了有利于神经元修复及轴突再生的微环境;(3)脊髓损伤后形成瘫痕组织阻碍了轴突的生长。目前治疗方法主要集中在细胞移植和组织工程上面。我们率先开展脱细胞脊髓支架的研究工作[1，2，3，4]。构建脊髓组织工程核心包括细胞组织工程支架与种子细胞。脱细胞脊髓支架是天然的生物材料，它具有多通道的空间结构[1]、免疫原性极低[2]、生物安全性良好[3]等优点，故我们选择它来作为研究对象。目前运用较多的组织工程重要的种子细胞是骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，特定条件下它能向多种细胞分化，如成纤维细胞，软骨、脂肪及神经元细胞等[5]，适合于再生医学，对中枢系统的再生具有重要的作用；此外该细胞取材简易方便，来源较广泛，易于体外扩增等优点，因此运用广泛[6]。本研究以BMSCs为种子细胞，与脱细胞脊髓支架进行共培养，观察其在支架上的粘附、生长及增殖情况，探索最佳接种浓度，以评价该支架材料应用于脊髓组织工程的可行性。研究方法：1无菌条件下分离SD大鼠BMSCs的原代，采用密度梯度离心法及细胞贴壁法纯化，用含10%胎牛血清+DMEM/F-12培养基培养细胞及传代。2BMSCs的鉴定:（1）流式细胞仪鉴定细胞表面抗原并设同型对照;(2)向神经元样细胞诱导的鉴定。加入预诱导剂(DMEM/F-12+10ng/ml bFGF)预诱导后，再加入诱导剂(DMEM/低糖+0.2mmol/L BHA）诱导,免疫荧光鉴定神经元标志物GFAP、Nestin、NSE。3取健康成年SD大鼠脊髓胸腰段脊髓数段，采用化学萃取和物理震荡的方法制备脱细胞脊髓支架，取部分支架经冷冻干燥及普通脱水后扫描电镜观察支架形态，剩余的支架材料经Co60辐照消毒后置于-20℃冰箱保存备用。4取第3代BMSCs同脱细胞脊髓支架共培养：（1）用于细胞增殖活性检测的共培养：实验组（共培养组，n=5），对照组（普通培养组，n=5），分别培养2、4、6、8d后MTT法检测细胞增殖活性（；2）用于测粘附率及细胞上架数的共培养：调整BMSCs为(0.5、1、2、3、4)×10~6/ml，0.5cm小段（体积约0.035cm3）共20段，置于5个96孔板内，分5组，每组4段（每孔1段，按5个浓度分别接种于支架材料），按5个浓度分别直接接种于96孔板内作为标准对照组，置于CO2孵箱中孵育24h后分别行MTT检测；（3）用于电镜的共培养：BMSCs与脱细胞脊髓支架共培养后扫描电镜观察细胞、支架的形态及细胞与支架的粘附情况。5统计学分析采用SPSS10.0统计软件，重复测试数据采用重复测量方差分析。细胞粘附率、上架细胞数的数据采用多种曲线回归分析，在结果中选取最优回归方程。研究结果：1成功实现了SD大鼠BMSCs的原代分离培养及传代，BMSCs通过检测所表达的特异性抗原，CD29(+)、CD90(+)阳性率分别为99.8%、99.1%，而造血干细胞的标志性抗原CD34(-)、CD45(-)，同型对照均为阴性。加入(DMEM/低糖+0.2mmol/L BHA）诱导5h后细胞胞体收缩，伸出多个突起，形态类似于神经细胞。免疫荧光检测GFAP、Nestin、NSE均呈阳性表达。2采用化学萃取和物理震荡的方法成功制备脱细胞脊髓支架，细胞成分大部分去掉，可见细胞脱落后多通道孔隙结构保存较好，各通道之间相互交通形成良好空间网状结构。3BMSCs与脱细胞支架材料共培养后在扫描电镜观察可见细胞在多孔脱细胞支架上粘附良好。4BMSCs与脱细胞支架材料共培养时间分别为2、4、6、8天时，共培养组的细胞增殖活性比普通培养的细胞增殖活性显著性增加（P＜0.05）。5BMSCs与脱细胞支架材料共培养，随着接种细胞浓度的增加粘附率也增加，在接种细胞浓度为2ｘ10~6时粘附率最高达到(79.6±2.7)%，随着接种细胞浓度增加时粘附率反而下降，回归分析显示，二者呈对数函数关系，再接种浓度大于2ｘ10~6/ml时，函数值增长减慢，提示上架细胞数增长缓慢或不再增长，它提示2ｘ10~6/ml浓度基本为为最佳接种浓度，单位体积上架细胞数在此浓度时也基本达到最大值约（1.364±0.047）x10~6/cm3。研究结论：脱细胞脊髓支架具有多通道的空间结构，适合BMSCs粘附、存活、增殖，该支架是良好的天然脊髓组织工程材料。当接种浓度为2×10~6/mL，粘附率及细胞上架数液基本达到最大值，此浓度为最佳接种浓度。