研究背景据估计全世界约有10％的育龄夫妇不育，其中接近半数的原因是精子发生障碍。在排除输精管梗阻、克氏症和其它泌尿生殖系原因后，无精子症和严重少精子症最有可能的原因就是精子发生基因的异常。关于精子发生基因，特别应关注Y染色体长臂11间隔。Y染色体构成人类基因组的2％，由短臂(Yp)和长臂(Yq)组成。1976年Tiepolo和Zuffardi通过对男性不育症患者Y染色体微缺失的分析，首次提出Y染色体长臂在精子发生过程中扮演着关键的作用。无精子症和严重少精子症患者的细胞遗传学和分子生物学研究也证实：在人类Y染色体上存在着无精子因子(Azoospermia factor，AZF)。通过分子标记物来显示Y染色体的密度，大量缺失图谱的研究至少能确定三个清楚的、非重叠的区域伴有不同程度生精障碍，位于Y染色体长臂的这三个区域分别命名为AZFa、AZFb和AZFc。有作者在AZFc区附近又发现了AZFd，据报道这些区域的微缺失能够干扰精子发生继而引起男性不育。在这些区域里有数个控制精子发生的候选基因，它们在人类精子发生过程中有着重要的功能。1993年，Ma通过对男性不育症患者的研究首先报道了在Y染色体上一个特殊基因家族的两个cDNA，也就是RBM(RNA binding motif)基因。1995年，Reijo通过对无精子症患者Y染色体长臂AZFc间隔的研究发现了DAZ(Deleted in azoospermia)基因。RBM、DAZ分别作为AZFb和AZFc区控制精子发生的候选基因，它们编码RNA结合蛋白，同时对结合蛋白具有调节和代谢作用。随着人工辅助生育技术(Assisted reproductive technology，ART)的发展，Y染色体微缺失能够传递给男性子孙，这些男性后代同样面临着不育的问题。因此，我们应该把这种可能性告诉给不育症夫妇，并向他们解释进行Y染色体微缺失分析的必要性。目的本研究的目的是评估国人中男性特发性不育和伴有精索静脉曲张或隐睾的非特发性不育患者Y染色体微缺失发生的频率，并探讨Y染色体微缺失检测的临床意义。材料和方法2003年7月～2005年3月143例严重少精子症(2～5×10~6／ml)和无精子症患者均来自男性不育症门诊。其中36例因隐睾行睾丸下降固定术，手术时间为1.5～3.0岁，平均2.1岁，其中严重少精子症21例，无精子症15例；45例因精索静脉曲张而行精索内静脉高位结扎术，手术时间为19～32岁，平均23岁，其中严重少精子症30例，无精子症15例；62例诊断为特发性不育(idiopathic infertility)，其中严重少精子症29例，无精子症33例。所有的患者都有正常的46XY核型；睾丸体积采用国际通用的睾丸体积测量器测量，睾丸大小在正常范围内(15～25ml)；卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和睾丸激素(testosterone，T)通过放射免疫法(radio immunoassay，RIA)来测定。男性特发性不育患者均通过临床检查排除精索静脉曲张、附睾损伤、隐睾、阻塞性无子精症或其他泌尿生殖系疾患。无精子症和严重少精子症患者的精液标本需连续3次，每次间隔3周，随后经3d禁欲后获得，并符合世界卫生组织的诊断标准。不育症患者的睾丸结构通过双侧睾丸细针穿刺细胞学(fine needle aspiration cytology，FNAC)来分析。此外，40例健康生育男性和1例女性作为对照。基因组DNA来自外周血细胞样本并在-20℃保存。8对引物为AZFa区的sY84和sY86，AZFb区的sY127和sY134，AZFc区的sY254和sY255以及作为内对照的SRY(Sex determining region，sY14)和锌指蛋白基因(ZFY)。两个多重聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)包括：Mix1：SRY(sY14)—ZFY—sY84—sY134—sY255和Mix2：SRY(sY14)—ZFY—sY86—sY127—sY254。空白、女性和健康男性生育者DNA作为外部对照。为排除假阳性反应，对微缺失的标本进行3次PCR重复检测，上述缺失仍无扩增信号，而SY14(SRY)和ZFY均能正常扩增，则证实微缺失的存在。使用STATA 7.0统计软件。用确切概率法分析3组(特发性不育组，非特发性不育组和对照组)Y染色体微缺失发生的频率；分析严重少精子症和无精子症患者中特发性不育组和非特发性不育组Y染色体微缺失发生的频率；分析2组(严重少精子症组和无精子症组)Y染色体微缺失发生的频率。P＜0.05为显著性差异，有统计学意义。结果1．Y染色体微缺失分析：待测的标本，经PCR检测均能检出SRY和ZFY基因特异性片段，这表明所检测的DNA模板符合要求，整个扩增系统有效。在核型正常的不育患者中，我们发现21例(21／143，14.7％)微缺失，其中特发性不育患者12例(12／62，19.4％)，非特发性不育患者9例(9／81，11.1％)。40例健康生育男性均可见8条扩增带，而空白对照中未见扩增带。结果表明在12例特发性不育患者微缺失中，1例为AZFb+c区微缺失(1／21，4.8％)，2例为AZFb区微缺失(2／21，9.5％)，9例为AZFc区的DAZ基因微缺失(9／21，42.9％)；在9例非特发性不育患者微缺失中，1例在AZFa区(1／21，4.8％)，1例在AZFb+C区(1／21，4.8％)，7例在AZFc区(7／21，33.3％)。2．微缺失患者的睾九病理：本组Y染色体微缺失患者睾九病理表现为成熟阻滞(Maturation arrest，MA)、严重精子发生低下(Severe hypospermatogenesis，SH)和唯支持细胞综合征(Sertoli cell-only syndrome，SCOS)。其中4例为成熟阻滞，6例为严重精子发生低下，11例为唯支持细胞综合征。3．Y染色体微缺失发生率的比较：本研究中3组(特发性不育组，非特发性不育组和对照组)Y染色体微缺失发生率分别为19.35％(12／62)，11.11％(9／81)和0.00％(0／40)。特发性不育组与非特发性不育组间差异无统计学意义(P=0.233)，而特发性不育组或非特发性不育组与对照组之间差异有统计学意义(P=0.003，P=0.029)；严重少精子症患者中，特发性不育组和非特发性不育组Y染色体微缺失发生率分别为10.34％(3／29)和5.88％(3／51)，两组间差异无统计学意义(P=0.662)；无精子症患者中，特发性不育组和非特发性不育组Y染色体微缺失发生率分别为27.27％(9／33)和20.00％(6／30)，两组间差异无统计学意义(P=0.564)；严重少精子症组和无精子症组Y染色体微缺失发生的频率分别为7.50％(6／80)和23.81％(15／63)，两组间差异有统计学意义(P=0.008)。结论1．本研究的检测结果显示在特发性不育患者中Y染色体微缺失发生率是19.4％，重要的是在非特发性不育患者中微缺失发生率也达11.1％。按照目前的约定认为特发性无精子症和严重少精子症患者应进行Y染色体微缺失的检测。基于我们的研究，建议Y染色体微缺失的检测应包括特发性不育和非特发性不育，特别是寻求经卵胞内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治疗的患者。2．本研究已经检测到有一部分患者是由于Y染色体上AZF区的微缺失而造成的生精障碍，但是，大部分患者无精子或少精子的原因不清楚，这可能是因为存在某些更微小的缺失或点突变，或因为某些精子发生相关基因位于所研究的区域之外，甚至位于常染色体上，因此有必要再去寻找新的精子发生基因。严重少精子和无精子的不育患者Y染色体微缺失的研究第二部分：特发性不育患者外周血和睾丸组织中Y染色体微缺失的比较研究研究背景据估计全世界约有10％的育龄夫妇不育，其中接近半数的原因是精子发生障碍。在排除输精管梗阻、克氏症和其它泌尿生殖系原因后，无精子症和严重少精子症最有可能的原因就是精子发生基因的异常。关于精子发生基因，特别应关注位于Y染色体长臂的这三个区域，即AZFa、AZFb和AZFc区。这些区域的微缺失能够干扰精子发生继而引起男性不育。在这些区域里有数个控制精子发生的候选基因，它们在人类精子发生过程中有着重要的功能。DFFRY基因目前认为是AZFa区重要的候选成分之一。DFFRY是单拷贝基因，在X染色体上有一个同源基因，在男性生殖细胞中表达，编码一个非特异性的C末端水解酶。AZFb区的RBM基因家族包含30个基因和假基因，其又可分成不同的亚群分布在人类Y染色体的长、短臂上。其编码RNA结合旦白，在人类睾丸中的表达已说明这种蛋白质仅见于生殖细胞核内，出现在除精子细胞以外精子发生的各个阶段。DAZ基因是AZFc区最主要的候选基因之一，DAZ被特异性表达在睾丸。DAZ和RBM编码RNA结合蛋白，与常染色体基因hnRNPG同源，同时对结合蛋白具有调节和代谢作用。AZFa和AZFb大小为1-3Mb，AZFc为3Mb。目前有60％的无精子症和严重少精子症患者被诊断为特发性不育，研究显示10～15％的特发性无精子症和5～10％的严重少精子症患者有Y染色体微缺失。随着人工辅助生育技术的发展，Y染色体微缺失能够传递给男性子孙，这些男性后代同样面临着不育的问题。因此，我们应该把这种可能性告诉给不育症夫妇，并向他们解释进行Y染色体微缺失分析的必要性。目的本研究的目的是比较研究国人中男性特发性不育患者外周血和睾丸组织中Y染色体微缺失是否存在不同，并探讨Y染色体微缺失检测的临床意义。材料和方法62例特发性不育患者来自男性不育症门诊。其中严重少精子症(2～5×10~6／ml)29例，无精子症33例。所有的患者都有正常的46XY核型；睾丸体积采用国际通用的睾丸体积测量器测量，睾丸大小在正常范围内(15～25ml)；性激素促卵泡素和睾丸激素通过放射免疫法来测定。男性特发性不育患者均通过临床检查排除精索静脉曲张、附睾损伤、隐睾、阻塞性无子精症或其他泌尿生殖系疾患。无精子症和严重少精子症患者的精液标本需连续3次，每次间隔3周，随后经3d禁欲后获得，并符合世界卫生组织的诊断标准。不育症患者的睾九结构通过双侧睾丸细针穿刺细胞学来分析。此外，40例健康生育男性和1例女性作为对照。基因组DNA来自外周血细胞样本并在-20℃保存。8对引物为AZFa区的sY84和sY86，AZFb区的sY127和sY134，AZFc区的sY254和sY255以及作为内对照的SRY(sY14)和ZFY。两个多重聚合酶链反应(PCR)包括：Mix1：SRY(sY14)—ZFY—sY84—sY134—sY255和Mix2：SRY(sY14)—ZFY—sY86—sY127—sY254。空白、女性和健康男性生育者DNA作为外部对照。所有患者睾丸标本均通过FNAC取得，并立即保存在液氮中。应用Trizol方法从液氮冷冻组织中提取总RNA，在AMV反转录酶作用下完成由RNA反转录为cDNA的过程。聚合酶链反应(PCR)包括：SRY(sY14)—DFFRY—RBM—DAZ—β-actin。人β-actin作为cDNA模板的阳性对照。结果1．外周血Y染色体微缺失分析在第一部分结果中已显示：在核型正常的62例特发性不育患者中，我们发现12例(12／62，19.4％)有Y染色体微缺失。在12例特发性不育患者微缺失中，1例(样本63)为AZFb+c区微缺失(1／21，4.8％)，2例(样本80和82)为AZFb区微缺失(2／21，9.5％)，9例(样本9，11，27，43，69，75，77，96和116)为AZFc区的DAZ基因微缺失(9／21，42.9％)。2．睾丸组织中Y染色体微缺失分析我们采用反转录聚合酶链反应(Raverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)对62例特发性不育症患者，作双侧睾丸细针穿刺细胞学研究，测定睾丸内的DAZ、RBM及SRY的mRNA。RT-PCR显示：62例均可见SRY阳性表达；2例(样本80和116)未见RBM mRNA表达；1例(样本63)同时未见RBM和DAZ mRNA表达；而在原发性不育患者中，有12例(样本9，11，27，28，33，43，69，72，75，77，96和116)DAZ未表达，其中3例(样本28，33和72)在白细胞内DAZ基因正常，而在睾丸细胞内的DAZ mRNA缺失。结论1．本研究的检测结果初步显示在特发性不育患者睾丸组织也存在Y染色体微缺失。睾丸组织RT-PCR的检测也有助于确定特发性不育的病因。2．ICSI是目前治疗男性不育的重要手段之一，它能使不育夫妇产生后代，但也能使遗传缺陷传给下一代。事实上，睾丸生殖细胞中的微缺失能够产生带有微缺失的精子，假如这些精子与卵细胞相遇，将产生一个带有Y染色体微缺失的个体，后代继承了他父亲生殖细胞中的微缺失。本研究表明特发性不育患者睾九组织RT-PCR和外周血PCR检测有助于TESE-ICSI治疗，避免遗传缺陷传给下一代。