论文部分内容阅读
目的:探究双调蛋白(Amphiregulin,Areg)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)所致肺泡上皮细胞间紧密连接损伤的作用及机制。方法:本实验分为动物实验和细胞实验两个部分。在动物试验中,选取6-8周龄雄性C57BL/6小鼠,体重为22-24g,随机分为(1)对照组(Control组)、(2)脂多糖组(PBS+LPS组)、(3)Areg组、(4)LPS+Areg组(每组n=8)。Control组小鼠腹腔注射与Areg等体积无菌PBS溶液;Areg组小鼠腹腔注射重组小鼠Areg(rm Areg,5μg/只);PBS+LPS组小鼠在腹腔注射与Areg等体积无菌PBS溶液,30min后气管滴注LPS(3mg/kg),Areg+LPS组小鼠腹腔注射重组小鼠Areg(rm Areg,5μg/只),30min后同样气管滴入LPS(3mg/kg)。24h后处理小鼠,取肺组织以及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。对于肺组织:称量各组小鼠肺组织干湿重;光学显微镜观察肺组织石蜡切片HE染色,行肺损伤评分;免疫荧光检测肺组织中紧密连接蛋白ZO-1,occludin和claudin-1的含量和分布情况;western blot检测肺组织中三种紧密连接蛋白的表达量以及各组小鼠肺组织EGFR和AKT的磷酸化水平。对于BALF:计数BALF中总细胞数量;BCA法检测BALF中总蛋白量;酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测BALF中免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)三种渗出物的浓度。在细胞实验中,选用小鼠肺泡上皮细胞系(MLE-12细胞),随机分为(1)对照组(Control组)、(2)Areg组、(3)PBS+LPS组、(4)Areg+LPS组、(5)siRNA-Scramble组(si-Scr)、(6)siRNA-EGFR组(si-EGFR)。Control组给予与Areg等体积的无菌PBS溶液;Areg组给予Areg(100 ng/ml);PBS+LPS组:给予Areg等体积的PBS,孵育30 min后再给予LPS(1μg/ml);Areg+LPS组:给予Areg(100 ng/ml),孵育30 min后再给予LPS(1μg/ml);siRNA-Scramble组:将含有Scramble siRNA的Opti-MEM与含有Lipofectamine 3000的Opti-MEM混合孵育13min,再将混合液加入细胞培养基中转染,6h后更换为含10%FBS的DME/F12培养基,继续培养24h,给予Areg(100 ng/ml),细胞培养箱中孵育30 min后再给予LPS(1μg/ml);siRNA-EGFR组:将含有EGFR-siRNA的Opti-MEM和含有Lipofectamine 3000的Opti-MEM混合孵育13 min,将混合液加入细胞中培养,6h后更换为含10%FBS的DME/F12培养基,继续培养24 h后,给予Areg(100 ng/ml),孵育30 min后再给予LPS(1μg/ml)。应用细胞小室荧光素法测量单层细胞渗透性,应用免疫荧光实验、western blot实验,比较各组肺泡上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1,occludin,claudin-1的含量和分布情况,并比较各组间EGFR及其AKT磷酸化水平变化,需特别注意siRNA下调EGFR表达后,各组肺泡上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1,occludin和claudin-1的含量和分布情况。结果:1.相比于PBS+LPS组,Areg+LPS组小鼠肺组织HE染色可见较正常的肺泡结构,肺损伤评分显著降低(P<0.0001),肺湿干比下降(P<0.05),BALF中总蛋白下降(P<0.01),IgM渗出明显减少(P<0.0001);BALF中中性粒细胞数减少(P<0.01),TNF-α降低(P<0.05),IL-6明显减少(P<0.001);在细胞实验中,Areg干预后,LPS所致的MLE-12单层细胞渗透性升高得到缓解(P<0.05)。由此可知Areg能够减轻LPS所致肺组织病理学损伤及水肿情况,减少小鼠肺组织炎性渗出,改善肺泡上皮屏障功能。2.相比于PBS+LPS组,Areg+LPS组小鼠肺组织中western blot检测紧密连接蛋白ZO-1(P<0.01),occludin(P<0.0001),claudin-1(P<0.01)的含量有不同程度回升,在MLE-12肺泡上细胞中也得到了同样的结果。而在免疫荧光实验中,可观察到PBS+LPS组的肺组织和MLE-12中的ZO-1,occludin,claudin-1平均荧光强度较Control组低(P<0.0001),且分布状态呈断续点状;Areg+LPS组小鼠肺组织和MLE-12细胞中ZO-1(P<0.05),occludin(P<0.001),claudin-1(P<0.01)平均荧光强度增强,并且分布也出现连续的直线或圆弧形态。综上可知,Areg能够缓解LPS所致肺泡上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1,occludin,claudin-1丢失和分布异常,保护肺泡上皮屏障紧密连接。3.Western blot结果显示相比于Control组,Areg组和Areg+LPS组小鼠肺组织及MLE-12细胞中EGFR(P<0.0001),AKT(P<0.0001)发生明显磷酸化;4.siRNA下调MLE-12细胞中EGFR后,si-EGFR组MLE-12细胞EGFR表达量降低;相较于其他组,Areg对细胞中EGFR(P<0.001),AKT(P<0.05)的磷酸化作用减弱;5.si-EGFR组MLE-12较Control组、Areg+LPS组和si-Scr组单层细胞渗透性明显升高(P<0.0001)。Western blot和免疫荧光检测MLE-12细胞间紧密连接蛋白的含量和分布,发现Areg对三种紧密连接蛋白的保护作用消失,ZO-1,occludin,claudin-1的含量都显著下降(P<0.0001),也无法辨认正常的线形或弧形分布。以上说明抑制EGFR的表达,能够抑制Areg保护紧密连接蛋白ZO-1,occludin,claudin-1的含量和分布。结论:Areg通过激活EGFR和AKT信号通路,保护肺泡上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1,occludin,claudin-1,保护肺泡上皮屏障,减轻肺水肿,缓解ALI。